光合磷酸化偶联机制的研究寡霉素对PSP、ATP酶和ATP_b-Pi交换反应的作用

在过去工作基础上,我们进一步研究类囊体膜上牢固结合的ATP_b 与Pi 的交换反应和PSP 的关系。主要结果是:①在线粒体中对ATP 酶复合体的疏水蛋白专一敏感的寡霉素,对叶绿体中ATP 的光下形成和水解均表现为抑制,其中对ATP 酶活力的抑制要比对ATP 形成的抑制强烈得多,对核苷酸交换和光下H~ 吸收也有明显的抑制作用(表1)。②去除内源游离核苷酸的叶绿体悬浮液,与Pi(~(31)Pi ~(32)Pi)照光(不外加ADP),发现在适当的寡霉素浓度(20微克/毫克蛋白)下显著促进此系统ATP 中~(32)Pi 参入的数量;并且在所测温度下均促进,温度升高(30℃),促进作用更为明显(表2,3)。③用荧光素酶测定ATP 的方法对上述系统的反应产物进行鉴别,并与~(32)Pi酯化法相比较,证明寡霉素促进的是ATP_b-Pi 交换(图1,2;表4,6)。④ATP_b-Pi 交换反应与类囊体膜的能量转换有密切的关系。这交换反应需光、需辅助因子,也受解联剂的影响(表5),是需能反应。这ATP_b-Pi 交换,较之PSP 受解联剂的影响要小得多,可能它与膜上高能态有更为直接的联系。     

膜Ca~(2 )-Mg~(2 )-ATPase连续自动分析方法

目前,膜ATPase的活性测定主要是利用ATP再生系统,以及测定ATP水解所释放Pi的方法。比色测Pi的方法为Fiske所开创。Lacy改用抗坏血酸作还原剂,还原磷钼酸,提高了灵敏度。通常在中止酶反应,进行Pi比色测定之前,使用离心或过滤去除变性的酶蛋白。Klinc将酶水解产生的Pi透析到还原性试剂中,以进行Na~ -K~ -ATPase的自动分析。Arnold用表面活性剂溶解膜蛋白,省去过滤、离心或透析等步骤,进行膜ATPase的自动分析,具有简便、快速、灵敏度高、结果可靠等特点,本文基于Arnold的工作,全部使用国产仪器,用于红细胞膜Ca~(2 )Mg~(2 )-ATPase的分析。材料与方法 1、试剂 ATP(江门化工厂),Ouabain为Serva公司产品,其余均为国产分析纯试剂。     

膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase连续自动分析方法

目前,膜ATPase的活性测定主要是利用ATP再生系统,以及测定ATP水解所释放Pi的方法。比色测Pi的方法为Fiske所开创。Lacy改用抗坏血酸作还原剂,还原磷钼酸,提高了灵敏度。通常在中止酶反应,进行Pi比色测定之前,使用离心或过滤去除变性的酶蛋白。Kline将酶水解产生的Pi透析到还原性试剂中,以进行Na~+-K~+-ATPase的自动分析。Arnold用表面活性剂溶解膜蛋白,省去过滤、离心或透析等步骤,进行膜ATPase的自动分析,具有简便、快速、灵敏度高、结果可靠等特点,     

利用扰动角关联研究固氮酶反应的机理

结合新颖而敏感的受扰角关联(PAC)技术,初步利用了~(99)Mo,~(111)In作为研究固氮酶及其模型系统反应机理的探针。~(99)Mo,~(111)In发射的γ射线的角关联,当它们与化合物或生物大分子配位形成络合物时,就被强烈地干扰。实验指出:当~(99)MoO_4~-与半胱氨酸形成络合物时,~(99)Mo的角关联受扰,衰减因子G_2值降低。加入ATP,G_2值进一步降低,说明ATP对Mo-SH催化剂的Mo活性中心发生作用。在pH≈9.0左右的溶液中,只有那些具催化活性的固氮酶模型系统,G_2值降低。In~(+++)能代替Mg~(++)参与固氮酶反应,因此,~(111)In的PAC技术有助于阐明固氮酶的反应机理,特别是有关ATP的作用问题。     

ATP,Fe-S原子簇在固氮酶催化反应中的作用——模型研究

由无机钼盐与某些巯基化合物或巯基蛋白组成的固氮酶模型系统,以NaBH_4作还原剂,催化还原固氮酶的底物乙炔为乙烯。催化活性受ATP显著的促进。ATP的作用不能完全用质子酸来解释,因为催化活性的促进受ATP浓度、不同种类缓冲液和不同离子强度的影响。 在所有Mo-SH催化剂中,Mo-Fd催化活性最高。并且,在PH≌9.0左右的条件下,与固氮酶相仿,也能利用Na_2S_2O_4为还原剂,催化还原乙炔。当除去天然Fd的Fe-S辅基以后,剩下的蛋白部分再与无机钼盐配位络合,催化活性下降,而且不再能利用Na_2S_2O_4为还原剂。因此,Fd的特殊作用与它分子中含Fe-S原子簇相关。     

利用扰动角关联研究固氮酶反应的机理

结合新颖而敏感的受扰角关联(PAC)技术,初步利用了~(99)Mo,~(111)In 作为研究固氮酶及其模型系统反应机理的探针。~(99)Mo,~(111)In 发射的γ射线的角关联,当它们与化合物或生物大分子配位形成络合物时,就被强烈地干扰。实验指出:当~(99)MoO_4~-与半胱氢酲形成络合物时,~(99)Mo 的角关联受扰,衰减因子G_2值降低。加入ATP,G_2值进一步降低,说明ATP 对Mo-SH 催化剂的Mo 活性中心发生作用。在pH≌9.0左右的溶液中,只有那些具催化活性的固氮酶模型系统,G_2值降低。In~(+++)能代替Mg~(++)参与固氮酶反应,因此,~(111)In 的PAC 技术有助于阐明固氮酶的反应机理,特别是有关ATP 的作用问题。     

生物膜能量偶联ATP酶的研究:鼠肝线粒体ATP酶(F_1)~*的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP酶(F_1)在1MKCl-TEA缓冲液(Tris-So_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2 mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP酶水解活力和对DCCD的敏感性。     

生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

一种简便、灵敏的ATPase活性测定法

现有的ATPase活性测定方法是利用分光光度法,偶联丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的反应,测定NADH在340nm处光密度的减少,求出ATP的水解量,以及利用~(32)γ-ATP同位素测定或用比色法测定ATP水解的Pi等,后一方法因实验条件简单,仍是最常用的分析方法。Fiske建立的钼蓝比色法虽经改进,灵敏度仍较低。Itaya发现磷钼酸与孔雀石绿生成的复合物,有很高的克分子消光系数,可用于灵敏测定Pi。但用于ATPase分析时,酸性钼酸催化的底物ATP非酶促水解,将严重干扰对酶活性的测定。Lanzetta利用柠檬酸淬灭新生Pi(如     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

电子传递促进的ATP水解

铁蛋白在结合MgATP时,MgATP基本上不水解,只有在与钼铁蛋白结合并传递电子给钼铁蛋白时,MgATP才酶促水解为MgADP和Pi(磷酸根),电子传递和ATP的水解是两个快速的偶联过程。[Fe_4S_4(SPh)_4]~(-2)     

一种适用于眼晶状体Na~+,K~+-ATPase活性检测的改良无机磷测定法

目前膜ATPase的活性测定主要是利用ATP再生系统,以及测定ATP水解所释放的Pi的方法。Fiske和Subbarrow于1925年创立的用钼酸铵显色测定Pi的方法至今仍被广泛应用于ATP酶的测定,但此法的缺点是在显色过程中会造成有机磷的水解,影响Pi的测定尤其是在测定角膜和细胞组织中的ATP     

固氮酶中的电子传递

提出改进的二步ATP驱动的电子传递机理,对还原剂和MgATP都充足或其中有一种不充足的情况下固氮酶体系的FPR信号变化作了合理的解释.     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).     

溶血卵磷脂对大豆下胚轴质膜H^＋—ATPase ATP和对—硝基苯磷酸水解活性的影响

研究了溶血卵磷脂 (lysophosphatidylcholine,lyso PC)对大豆 (Glycinemax (L .)Merr.)下胚轴质膜H _ATPaseATP和对_硝基苯磷酸 (ρ_nitrophenylphosphate ,PNPP)水解的影响。结果显示 ,lyso_PC可以刺激ATP水解活力 ,当lyso_PC浓度在 0～ 0 .0 3%范围时 ,ATP水解活力明显提高 ,lyso_PC浓度高于 0 .0 3%后增加缓慢 ;当lyso_PC浓度为0 .0 3%时 ,ATP水解活力提高 80 .5 %。动力学分析表明 ,lyso_PC处理可以使ATP水解的Vmax从 0 .46 μmolPi·mg-1protein·min-1升高到 0 .87μmolPi·mg-1protein·min-1;使Km 从 0 .88mmol/L升高到 1.15mmol/L。最适pH也从 6 .5变为 7.0。实验还发现lyso_PC可以促进羟胺对ATP水解的抑制作用 ,lyso_PC处理后ATP水解被羟胺 (2 0 0mmol/L)抑制 84.4% ,而未经lyso_PC处理的对照组则仅被抑制 74.4%。然而 ,lyso_PC处理不影响PNPP水解活力和钒酸钠抑制效应。以上结果表明 ,质膜H _ATPase的激酶结构域可能是其C末端自抑制结构域的作用位点或调节区域     

焦磷酸在植物细胞能量代谢中的作用(综述)

ADVANCESINRESEARCHONTHEROLESOFPYROPHOSPHATEINCELLULARENERGYMETABOLISMOFPLANTSWangYixing(DepartmentofBiology,JinanUniversity,Guangzhou510632)LiMingqi(DepartmentofAgriculturalBiology,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642)焦磷酸（PPi）是一种高能化合物,其水解的G为-33．4kJmol,即PPi水解释放的自由能与ATP相似（ATP水解为ADP和Pi的G为-31．3kJmol）。但是对于焦磷酸代谢的传统观点是：细胞内焦磷酸水平很低,代谢中的焦磷酸,主要是在大分子如蛋白质、淀粉等生…     

(Zn·Cd)S:Ag-KI催化的光合磷酸化

以半导体材料(Zn·Cd)S:Ag-KI为催化剂,在普通卤钨灯光照射下,成功地模拟了光合作用的光合磷酸化.文章报导了光强、照光时间、ADP浓度、Pi浓度及催化剂量等对ATP合成的影响.在合适的条件下,ADP浓度为1×10~(-3)mmolL时转化率可达到4-6°.最后有一简单讨论.     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4~ 后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4~ 后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮螺菌中固氮酶活性的厌氧关闭与细胞内ATP／ADP比值的关系

本文研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)“玉-62”在以谷氨酸为氮源的好气液体培养条件下固氮酶活性厌氧关闭的机制。ATP 合成的解偶联剂 CCCP 使固氮酶迅速失活,Western blotting 实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白—亚基被修饰。用萤光素-萤光素酶法测定表明厌氧处理使细胞内 ATP/ADP 比值迅速下降,固氮酶活性亦迅速被抑制,重新供氧后细胞内 ATP/ADP 比值很快恢复到原水平,固氮酶活性亦迅速上升。CCCP处理亦使细胞内 ATP/ADP 比值迅速下降。低电位电子受体 Metronidazole 制固氮活性,但固氮酶铁蛋白不被修饰,细胞内 ATP/ADP 比值略上升。实验证明,细胞内 ATP/ADP 比值的变化是启动固氮酶铁蛋白修饰系统的信号分子。     

粘虫幼虫肠道蛋白水解酶特性的研究

本文研究了粘虫(Mythimna separata Walker)幼虫蛋白水解原酶和粗提的幼虫肠道蛋白水解酶的一些主要生化特性.实验结果表明:幼虫肠道蛋白水解酶温培后仍然保持最大酶活的最适温度是25℃,最适pH是11,从pH和酶活关系的曲线图可知原酶在pH9和10之间有一个“峰肩”,然而粗提酶则没有. 新鲜收集的幼虫原酶在30℃下经过2小时培养后,酶的活性可以提高10%.本研究也为寻找合适的粘虫幼虫蛋白水解酶的温度处理和作用条件提供了理论依据.