FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒载体的构建

为研制O型口蹄疫病毒(FMDV)复制缺陷型腺病毒活载体疫苗毒株,通过RT-PCR方法获得了O型FMDV的开放阅读框(ORF)基因,并定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVORF,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆得到的ORF编码基因序列与原始强毒株O型FMDV的ORF编码基因相似性达99.8%。将含有目的基因的穿梭质粒线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-2共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,得到重组腺病毒质粒pAd-ORF,经PCR和酶切鉴定正确。本研究成功获得了含有现代O型疫苗用FMDV毒株的全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒及其腺病毒骨架质粒。     

口蹄疫病毒O型中和抗体检测固相阻断ELISA方法的建立

【目的】为评价O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)灭活疫苗免疫后中和抗体(neutralizing antibodies,NA)水平,建立检测中和抗体的固相阻断ELISA (neutralizing antibodies solid-phase blocking ELISA,NA-SPBE)方法。【方法】本研究以本实验室前期制备的FMDV广谱反应性牛源单克隆抗体E32作为捕获抗体,以生物素标记的FMDV O型型内广谱中和牛源单克隆抗体C4作为检测抗体,经过条件优化建立了检测FMDV O型中和抗体的固相阻断ELISA方法,并对该方法进行了敏感性、特异性、重复性、交叉反应性与病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)相关性等试验。【结果】抗体E32最佳包被浓度为0.5 μg/mL,O型FMDV灭活抗原最佳稀释浓度为0.25μg/mL,生物素标记抗体C4-Bio最佳工作浓度为0.06 μg/mL,链霉亲和素-HRP的最佳稀释度为1:40 000。以1.35 log₁₀作为效价判定临界值时,敏感性和特异性分别为97.14%和98.84%。利用该方法分别检测FMDV A型、FMDV Asia1型、BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV抗体阳性血清时,均为阴性,未出现交叉反应。该方法批内和批间重复试验的变异系数均<10%,表明其重复性较好。利用该方法与VNT分别对160份血清样品进行检测,二者的相关系数r为0.807 5,P<0.000 1,相关性显著。【结论】该方法可以检测FMDV O型中和抗体,为FMDV O型灭活疫苗免疫效果评价提供有力技术支撑。     

猪O型口蹄疫病毒抗体化学发光酶联免疫检测方法的建立

表达并纯化猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1重组蛋白作为检测抗原,建立了一种快速检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测方法。建立的VP1-CLEIA方法特异性为100%,板内变异系数在1.10%–6.70%之间,板间变异系数在0.66%–4.80%之间,具有较好的特异性和重复性,且灵敏度高于ELISA方法。通过对山东、辽宁、河北地区采集的250份临床血清的检测表明,该方法与间接ELISA试剂盒的符合率为93.50%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率为94.00%,表明本次建立的VP1-CLEIA检测方法可以用于猪O型FMDV感染或疫苗免疫后抗体水平检测。     

克隆鸭乙型肝炎病毒DNA双体体内转染的研究

用一种含头尾相连DHBVDNA双体的质粒体内转染2日龄芙蓉鸭,大多数鸭（86％）产生了短暂病毒血症。血清DHBs／preSAg和DHBVDNA于转染后第9天出现,第12～14天达峰值,第28天时多数转阴;少数鸭的病毒血症可持续50天以上。转染鸭肝组织中也检测到复制中间型DHBVDNA的存在。用转染鸭病毒血症期的血清作磷钨酸负染电镜观察,找到了完整的DHBV病毒颗粒,并且用此血清腹腔注射1日龄鸭,60％的鸭被感染成功,证明体内转染后有生物活性的DHBV病毒颗粒的产生。该研究方法的建立．对于研究DHBV变异株．DHBV基因结构与功能的关系等,均有一定理论意义及应用价值。     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

小鼠体内SEG蛋白靶向运送shRNA抑制狂犬病毒复制

【目的】本试验前期已经证实,用单链抗体(sc Fv)-绿脓杆菌跨膜区(ETA)-酵母DNA结合结构域(GAL4)表达的蛋白(简写为SEG蛋白),SEG能与含sh RNA(short hairpin RNA)的质粒(p RNATU6.3-sh RNA)结合形成复合物SEG-sh RNA,并靶向运送该质粒进入感染狂犬病毒(Rabies virus,RV)的细胞,抑制RV复制。本研究用感染狂犬病病毒的小鼠模型,进行SEG-sh RNA复合物小鼠体内靶向性运送si RNA(short interfering RNA)和抑制RV复制的研究。【方法】用已建立RV CVS-24株小鼠肌肉注射模型进行试验。取50 LD_(50) CVS-24攻毒,在攻毒后12 h尾静脉注射SEG-sh RNA,流式细胞仪检测SEG-sh RNA的体内靶向性;同样方法攻毒后,尾静脉注射SEG-sh RNA,连续4 d,攻毒后第5天小鼠脑组织用q RT-PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测其中RV的含量;统计小鼠存活率;并检测小鼠体内IFN-α含量,从而分析SEG-sh RNA在体内的抗病毒作用。【结果】结果表明仅在RV攻毒小鼠的注射部位检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,未注射RV的腿部及脑、肝、脾、肾均无GFP表达,说明SEG-sh RNA可靶向RV感染细胞运送sh RNA。攻毒后第5天脑组织q RT-PCR结果表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍(3.9/0.8);RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色试验结果表明使用SEG-sh RNA组病毒量明显少于病毒对照组;且攻毒后13 d,动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-α未见升高。【结论】以上试验表明SEG蛋白在小鼠体内靶向运送含sh RNA的质粒到感染组织细胞;对小鼠体内RV有明显抑制作用,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。     

一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法

口蹄疫是一种一类传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV衣壳蛋白VP1含有中和性抗原表位。本研究合成了编码O型FMDVVP1蛋白中和性抗原表位的双拷贝DNA片段,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-1中,以获得的重组质粒转化大肠杆菌,然后用IPTG进行诱导,表达出了大小约为33kDa的GST融合重组蛋白,Westernblotting分析证实,重组蛋白可以被O型FMDV抗血清所识别。用纯化的重组蛋白免疫豚鼠制备高免血清,ELISA检测表明,免疫后的豚鼠血清抗体滴度可达1∶20560以上。本研究提供了一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法。     

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测

目的:对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法:非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果:受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的O型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论:猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257–264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大。     

三株口蹄疫病毒的克隆和基因型鉴定

目的：将O、A、Asia—Ⅰ型等3株口蹄疫病毒（FMDV）VP3-VP1—2A区域的一个片段克隆到pMD18-T载体上,构建阳性重组质粒,并且鉴定3株病毒所属的基因型。方法：将从中国农业科学院兰州兽医研究所获得的O、A、Asia—Ⅰ型灭活FMDV提取RNA作为模板,采用RT-PCR技术扩增了VP3-VP1-2A区域的一个约1070bp的片段,包含了全部的VP1序列;将其克隆到pMD18-T载体上,鉴定后得到阳性重组质粒;将目的片段进行序列测定、分析、绘制系统发育树,进而确定各灭活病毒的基因型。结果与结论：经鉴定,O型灭活FMDV属Cathay基因型,它与该基因型3条参考毒株序列的相似性在87％以上;A型灭活FMDV与参考株的相似性差异较大,但在系统发育树上可以看出该毒株属于Asia基因型;Asia-Ⅰ型FMDV只有1个基因型,将测序结果在NCBI网站上BIJAST,证实该灭活病毒为Asia—Ⅰ型。     

6株0型口蹄疫病毒结构蛋白vpl基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vpl基因的核苷酸序列同源性在95％～99．8％之间,氨基酸序列同源性在94．8％～100％之间。T1-T6六株病毒vpl基因的核苷酸序列与已经发表的O／HKN／14／82、O/TAW/81,97、O／PHI／7／96、O／HKN／1／99和O／HKN／16／96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86．1％～95．8％之间：发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathay topotype)。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

口蹄疫病毒基因组RNA结构与功能研究进展

1 概述 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)属小RNA病毒科FMDV属,根据动物交叉保护和血清学试验分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial 7个血清型,型间无交叉反应.每型又根据抗原亲缘关系分为不同亚型.小RNA病毒科包括鼻病毒、肠道病毒、甲肝病毒、心病毒和口蹄疫病毒5个属.     

中国口蹄疫病毒同源重组研究

从GenBank数据库中获得在我国分离的16株口蹄疫病毒全基因组序列,进而运用常规的系统发生方法分析了这16株病毒的同源重组情况,发现5株重组毒株．这些重组病毒主要来源于亚洲Ⅰ型(Asia1)和O型病毒间的重组．这些重组事件的鉴定也表明口蹄疫病毒间的交叉感染在我国比较常见．另外,在我国还出现了由于Asia1型和O型病毒重组后导致病毒血清型发生转化的现象．这些结果解释了我国口蹄疫病毒(FMDV)遗传多样性和抗原多变性的成因,提示了我国在口蹄疫预防、治疗方面所面临的复杂局面．     

细胞工程

900623 分泌抗口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株[英]/Butchaiah, G. …∥ Acta Virol.-1989,33(2).-121～130[译自DBA,1989,8(15),89-09176] 将伍合在弗氏完全佐剂的20～30μg口蹄疫病毒(FMDV)抗原经皮下或皮内免疫5～7周龄的BALB/c小鼠,然后,在第4和第12周再用伍合在弗氏不完全佐剂中的等量的抗原经皮下加强注射2次。4周     

链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5’-非编码区(5’-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。     

嵌合O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性

【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDV O/GSLX/CHN/2010的S片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯救得到两株基因工程嵌合病毒rGDexc、rGZexc;进而从病毒复制和病毒对乳鼠的致病力方面,对嵌合病毒、亲本基因工程病毒以及FMDV O/GSLX/CHN/2010株进行了评价。【结果】FMDV O/GSLX/CHN/2010株复制较慢,对乳鼠致病力较差。嵌合病毒和亲本基因工程病毒的复制能力、对乳鼠的致病力明显高于FMDV O/GSLX/CHN/2010株。【结论】研究表明FMDV O/GSLX/CHN/2010的S片段不能独自决定该病毒较差的复制能力和较弱的乳鼠致病力。这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制以及S片段对病毒生物学特性的影响奠定了基础。     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来.克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间.T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性.故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathaytopotype).     

流行性出血热(EHF)Ⅱ型疫苗生产中病毒株及原液的质控检测

流行性出血热Ⅱ型纯化疫苗(即亚单位疫苗)系用Ⅱ型Hautaan病毒R_(22)SM株感染乳鼠脑精制而成。为了保证疫苗生产和质量控制,我们对病毒株的繁殖量,感染度,毒力及纯毒株的中和指数作了实验性检测,依据检测的结果:用Ⅱ型EHF毒株R_(22)SM株乳鼠脑内接种感染后的第4或5天病毒在脑内开始出现,而大量繁殖则在接种感染后第7～8。其单一鼠脑内病毒繁殖量(病毒滴度)和制成单一收获原液中病毒含量基本相一致;脑内病毒滴度log LD_(50)为9.7;原悬液中病毒滴度log ID_(50)为11.2,纯毒试验的特异性中和指数为1378。如上所述,各种实验检测结果完全符合EHF疫苗生产规程指标要求。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。