沙门氏菌中dnd基因簇的缺失与异源表达

沙门氏菌Salmonella enterica serovar Cerro 87是一株从鸡场分离到的菌株, 其DNA骨架上的磷硫酰化导致了在高压脉冲电泳过程中DNA降解(DNA degradation, Dnd表型)。本研究采用SacB所介导的负筛选系统, 在该菌株中成功缺失了dnd基因簇, 构建了突变株XTG103, 该突变株不再具有Dnd表型。通过异丙基-b-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子PlacZ的转录可以调控DNA磷硫酰化修饰的dnd基因簇的异源表达。     

沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化

摘要:【目的】细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC 在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点 之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主［E. coli BL21 (DE3)pLysS］,获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8－18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50 μmol /L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50 μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe－4S的铁硫蛋白。     

含奥氏酮嗜盐紫色硫细菌的分离鉴定及系统发育分析

[目的]为挖掘我国紫色硫细菌物种和光合蛋白基因资源.[方法]采用Pfennig紫色硫细菌无机选择性培养基和琼脂稀释法.[结果]从青岛东风盐场分离获得一株含奥氏酮、耐高浓度硫化物、嗜盐耐碱紫色硫细菌菌株283-1.该菌株能氧化硫化物产生硫粒储存在细胞内、嗜盐、细胞含有奥氏酮类胡萝卜素、细菌叶绿素a强吸收峰位于830 nm处、运动、不产生气囊,表明属于Marichromatium属.16S rDNA序列同源性比较和系统发育分析也表明这一点.但该菌株能在1%～15%NaCl、7.5 mmol/L 高浓度硫化物、45℃、5000lux、pH9.0条件下生长良好,能很好的光同化C3和C4有机酸和葡萄糖酸钠等特性,与Marichromatium属4个种有明显不同.[结论]菌株283-1是Marichromatium属一个新分离物,编号 Marichromatium sp.283-1.     

Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用

在前期研究中,已发现人瘦素（leptin）在体外再折叠过程中会形成稳定的二聚体,但其二聚化机制尚不清楚. 本研究旨在分析瘦素二聚体的结构特性,并重点研究体外再折叠过程中瘦素二聚化的机制. 相较与瘦素单体,瘦素二聚体保留了约75％免疫活性及15％受体结合活性,同时显示出明显慢的天然电泳迁移率. 圆二色性分析显示,二聚体基本保留了单体α螺旋索结构特征. 还原性及非还原性凝胶电泳分析和自由巯基测定结果表明,瘦素二聚体是由一对分子间二硫键连接2个单体而成的.为了确定瘦素二聚化过程中起主导作用的分子间二硫键,利用PCR定点突变技术构建了C96S和C146S两个突变体瘦素. 通过分析C96S及C146S突变体瘦素的体外再折叠特性及过程,并与野生型瘦素相比较,揭示C96S瘦素的二聚体显示出与野生型瘦素二聚体相似的特性,而C146S瘦素不能形成结构稳定的二聚体. 以上研究结果表明,Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用.     

黑曲霉硫氧还蛋白的克隆表达纯化及其酶活位点特征分析

首次从黑曲霉Aspergillus niger全基因组中克隆出黑曲霉硫氧还原蛋白基因AnTrx,并对其编码蛋白的第33-37位保守区的活性位点实施定点突变C34S、C37S及C34S-C37S,获得相应的3个定点突变基因。将野生型AnTrx及其突变子分别在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达,比浊法测定纯化的各表达产物还原牛胰岛素α与β链之间二硫键的活性。结果表明,AnTrx的3个突变体都不表现明显催化活性。当突变型与野生型AnTrx等量混合后,发现突变型AnTrx-C34S可显著提高野生型AnTrx的催化效率,而突变型AnTrx-C37S却无此功能。由此证明,AnTrx活性结构域的第37位Cys残基上的巯基能参与攻击硫氧还蛋白和底物蛋白所形成的二硫键而释放被还原的底物蛋白,而第34位Cys残基同其他微生物的同一活性域一样参与硫氧化还蛋白与底物的结合。这一结果有助于认识真菌硫氧还蛋白第37位活性位点的作用。     

玉米过氧化物还原蛋白BAS1的原核表达及其功能研究

植物过氧化物还原蛋白BAS1是巯基依赖的过氧化物酶,通过催化的Cys残基还原过氧化氢,依赖NADPH的叶绿体硫氧还蛋白还原酶保持BAS1的还原态。玉米含有两种BAS1:2-Cys PrxA和2-Cys PrxB。利用RT-PCR方法从玉米幼叶中克隆了编码成熟2-Cys PrxA的基因,并将蛋白Cys34残基突变成Ser34。SDS-PAGE显示纯化的野生型和突变体蛋白为一条主带,分子量约为23kDa;体外蛋白结合实验表明纯化的叶绿体硫氧还蛋白还原酶通过分子间二硫键结合纯化的2Cys PrxA的C34S突变体,非还原SDS-PAGE显示纯化的野生型2Cys PrxA含有分子间二硫键组成的二体,而纯化的C34S突变体呈现单体,巯基专一性标记化合物AMS修饰及活性分析表明纯化的BAS1还原态是催化还原过氧化氢所所必须的,它由硫氧还蛋白还原酶及其辅酶NADPH所催化。     

与耳聋相关的线粒体12S rRNA突变

线粒体DNA突变是引起听力损伤的重要原因之一. 其中,线粒体12S rRNA基因突变与综合征型耳聋和非综合征型耳聋相关. 导致综合征型耳聋的线粒体DNA突变多为异质性,然 而对于非综合征型耳聋突变则多以同质性或高度异质性存在,说明这种分子致病性需要较高的阈值. 位于12S rRNA解码区的A1555G和C1494T突变是造成氨基糖甙类抗生素耳毒性和 非综合征型耳聋常见的分子机制. 这些突变可能造成12S rRNA二级结构的改变,影响线粒体蛋白质的合成,降低细胞内ATP的产生,由此引起的线粒体功能障碍导致耳聋. 但是多数 基因突变的致病机制还仅处于推测阶段. 其它修饰因子如氨基糖甙类抗生素、线粒体单体型、核修饰基因参与了线粒体12S rRNA基因A1555G和C1494T突变相关的耳聋表型表达.     

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明,Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

基于生物信息学分析SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2受体结合机制

[目的]预测并分析ACE2受体与SARS-CoV-2S蛋白结合的机制.[方法]从NCBI数据库中获取S蛋白及ACE2蛋白的氨基酸序列,利用在线软件分析其理化性质、高级结构及功能域,通过STRING软件构建ACE2蛋白相互作用网络,分析其关联通路和代谢途径.[结果]S蛋白由1 273个氨基酸组成,与SARS-COVS蛋白...