流感病毒反向遗传学技术研究进展

流感病毒亚型众多,且极易发生变异,给防控带来很大困难,所以当务之急应加强其在致病机理、传播机制等方面的研究和加快新型流感疫苗的开发．近年来,反向遗传学技术的发展为流感病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路．     

利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株

利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6 2全禽源的重配AIV。将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cD-NA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒。将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72~90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,最终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株。     

弹状病毒反向遗传操作系统研究进展

弹状病毒是一类重要的共患病病原,可引起人、动物、植物等多种生物的严重疫病。该病毒属不分节段的负链RNA病毒,其基因组相对简单。近年来,随着基因操作技术的发展,弹状病毒反向遗传操作系统技术研究取得显著成果。本综述从弹状病毒概论、弹状病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗研究中的应用等方面概述其反向遗传操作的研究进展,以期为弹状病毒防控相关研究提供参考。     

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞,得到了具有活性的甲型流感病毒.采用自行构建的含有polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间,得到了8个可在真核细胞中复制和表达的质粒.将这8个质粒共转染293T细胞,培养48h后吸取上清液,转接入MDCK细胞中,再经过72h培养,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生,测上清病毒血凝滴度为1:10.将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1).此结果将有助于国内今后对流感疫苗的研究.     

流感病毒的反向遗传学研究进展

反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,以对其进行功能和表型的分析[1]。它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点     

冠状病毒反向遗传技术的研究进展和应用

冠状病毒（Coronavirus,CoV）在分类上属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,其基因组长度约为25 000 nt～30 000 nt。反向遗传技术可以针对RNA病毒的基因组进行突变,是研究病毒蛋白功能的有力工具,也是对毒力基因进行突变,构建减毒疫苗株的新型方法。冠状病毒反向遗传技术的建立和应用,推动了基因功能的研究和重组病毒疫苗的研发。本综述将介绍三种常见的冠状病毒反向遗传克隆技术,分别是基于痘病毒载体、基于细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体和基于体外连接的反向遗传技术。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是成功建立反向遗传系统的冠状病毒之一,本文对反向遗传技术在IBV中的研究和应用进行了介绍和讨论。     

冷适应减毒B型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定

以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变．构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为：pAB121-PB1, pAB122-PB2, pAB123-PA, pAB124-HA, pAB125-NP, pAB126-NA, pAB127-M和pAB128-NS．在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B．该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/2004．rMDV-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512．实验结果暗示：从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型．     

人3型副流感病毒减毒活疫苗的研究进展

人副流感病毒(human parainfluenza viruses,HPIVs)是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要病原体,人3型副流感病毒(human parainfluenza viruses type 3,HPIV-3)是HPIVs中最主要的型别。目前尚无针对HPIVs的上市疫苗和有效的抗病毒药物,研发减毒活疫苗是目前开发HPIVs疫苗的方向。本文主要对HPIV-3减毒活疫苗的研究进展作一综述。     

A型流感病毒非结构蛋白NS1与宿主相互作用的研究进展

作为A型流感病毒的非结构蛋白,NS1蛋白是流感病毒的一个重要的毒力因子,决定了病毒在宿主细胞内的破坏作用。概述了NS1蛋白对宿主细胞蛋白合成、宿主细胞凋亡的影响,及其拮抗干扰素的作用。     

反向遗传学技术在疫苗研究的进展

本文通过反向遗传学技术的基本原理,发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用,重点介绍了反向遗传学技术在流感病毒疫苗方面的应用。     

口蹄疫病毒反向遗传学研究进展

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用, 使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展, 目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作, 综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系、病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展, 展望FMDV反向遗传学研究新动向。     

反向遗传学在呼吸道合胞病毒减毒活疫苗研究中的应用

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原,减毒RSV活疫苗能模拟自然感染充分活化机体固有免疫系统,并诱导产生体液免疫和细胞免疫,不会产生疾病增强作用,经黏膜途径应用,能突破母传抗体的干扰,因而受到广泛关注,反向遗传学(reverse genetics)在减轻野生型RSV毒力和增强其免疫原性等方面具有传统减毒技术不可比拟的优势,所以综述了反向遗传学在RSV减毒活疫苗研究中的应用。     

流感病毒的分子生物学研究进展

流感病毒是分节段的负链RNA病毒,由RNA依赖的RNA聚合酶起始病毒的复制。流感病毒的特殊基因组结构和病毒蛋白的功能使其极易发生抗原转换和抗原漂移,这使得病毒能够逃避多种宿主的长效中和性免疫反应。本文从病毒结构、基因组及其编码蛋白质、病毒复制过程和病毒的易感宿主等几方面论述了流感病毒的分子生物学研究进展。     

利用反向遗传技术制备重组人类偏肺病毒

利用反向遗传技术, 将包含人偏肺病毒2个血清型A和B代表株NL/1/00和NL/1/99全基因组cDNA的质粒及其4种辅助蛋白N、P、L、M2.1的表达质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别共转染BSR-T7细胞以制备重组hMPV。3 μg 全长cDNA质粒, 辅助蛋白质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别为0.3 μg、0.15 μg、0.3 μg和0.24 μg, 通过Lipofectamine 2000转染BSR-T7细胞,     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

Microarray Multiplex Assay for the Simultaneous Detection and Discrimination of Influenza A and Influenza B Viruses

In this study, we present a microarray approach for the typing of influenza A and B viruses, and the subtyping of H1 and H3 subtypes. We designed four pairs of specific multiplex RT-PCR primers and eight specific oligonucleotide probes and prepared microarrays to identify the specific subtype of influenza virus. Through amplification and fluorescent marking of the multiplex RT-PCR products on the M gene of influenza A and B viruses and the HA gene of subtypes H1 and H3, the PCR products were hybridized with the microarray, and the results were analyzed using a microarray scanner. The results demonstrate that the chip developed by our research institute can detect influenza A and B viruses specifically and identify the subtypes H1 and H3 at a minimum concentration of 1 × 10² copies/μL of viral RNA. We tested 35 clinical samples and our results were identical to other fluorescent methods. The microarray approach developed in this study provides a reliable method for the monitoring and testing of seasonal influenza.     

冠状病毒反向遗传操作技术及其应用进展

冠状病毒广泛存于自然界中,人和多种动物均易感。虽然冠状病毒具有相对严格的宿主特异性,但是其广泛的宿主性及其自身基因组的结构特性使得该病毒在进化过程中极易发生基因重组和突变,新型冠状病毒在此过程中不断出现。近年来,反向遗传学技术的发展为冠状病毒跨种属传播及致病机制、疫苗以及抗病毒药物的研发开辟了新的思路。对冠状病毒反向遗传操作技术的进展及其应用现状进行了简要综述与展望。