Cramp过表达对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

目的研究Cramp蛋白过表达对小鼠骨髓造血干细胞自我更新和分化能力的影响。方法应用流式细胞仪分析Cramp过表达转基因小鼠及同龄野生型小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例;分选骨髓造血干细胞,体外培养,观察其克隆形成能力。结果与野生型小鼠相比,Cramp过表达转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例、骨髓造血干细胞的克隆形成能力等均无明显变化。结论本研究中,Cramp过表达转基因小鼠骨髓造血干细胞的分化能力、克隆形成能力无明显变化。     

免疫磁珠纯化小鼠精原干细胞的研究

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）富集纯化是利用SSCs进行基因修饰新方法等研究的前提基础。采用免疫磁珠分选法,使用干细胞抗体CD90.2进行小鼠SSCs的纯化富集,并采用流式细胞分析法和定量PCR验证了磁珠分选效率。流式细胞分析结果：免疫磁珠分选后SSCs纯度为50.11%。荧光定量PCR检测结果：磁珠分选后支持细胞特异表达基因 GATA4 显著下调（6倍）、SSCs表达基因 GFRα-1 上调（6.5倍）、生殖干细胞特异表达基因 OCT4 极显著上调（5.9倍）,3个基因相对表达量的变化说明,免疫磁珠分选效率为6倍。流式细胞分析法所产生的偏差可能是受到了未解离磁珠及SSCs本身转基因荧光的影响。     

抑制小鼠乳腺肿瘤转移 microRNA 的筛选

目的：鉴定25种microRNA的功能及其在乳腺癌中发挥的作用,以筛选新的抑制乳腺癌转移的microRNA分子。方法利用脂质体2000将25种鼠源microRNA表达载体转染至4TO7细胞,经G418筛选结合流式细胞仪分选获绿色荧光细胞得稳定表达鼠源microRNA 的细胞株。将细胞2＆#215;105个/只尾静脉注射接种于BALB/C小鼠,14 d后解剖分离肺组织,统计小鼠肺组织结节数目。结果和接种阴性对照细胞小鼠相比,接种mir-449a稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移减少。而接种 mir-1935稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移增多。其它23种microRNA稳转细胞接种小鼠肿瘤肺转移既不增加也不减少。结论从25种鼠源microRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌细胞肺转移,mir-1935则促进癌细胞肺转移。     

Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响

目的 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响。方法流式细胞仪分选小鼠骨髓造血干细胞、体外单克隆培养,竞争性骨髓移植,放射线照射观察生存曲线。结果 Gadd45a基因缺失的小鼠造血干细胞克隆形成能力增强,短期造血重建能力无差异,8.5Gy放射线照射后生存情况无差异。结论 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能起重要作用。     

小鼠骨髓造血干细胞的分离纯化及电镜观察

应用免疫磁珠分选结合流式细胞术与透射电镜术对小鼠骨髓造血干细胞进行了分离、纯化及透射电镜观察。结果显示,20只小鼠的骨髓细胞经分离纯化后,共收集到2×105个造血干细胞,纯度达95%以上;其形态类似于小淋巴细胞,呈单核,近圆形,直径约5~7μm,核大细胞质少,染色质电子密度不均,除了线粒体和一些囊泡外,较少见到其他细胞器。经分离纯化的小鼠骨髓造血干细胞纯度好、活率高,可制成透射电镜标本,并能清晰观察其超微结构特征。该研究方法试图找出小鼠骨髓造血干细胞在形态学上的特征,为后续研究提供实验基础,且对探讨造血细胞结构与功能的关系具有一定的应用价值。     

不同流式抗体分选小鼠原位肝癌模型中髓系来源抑制性细胞的比较

目的比较不同的流式抗体分选小鼠原位肝癌模型骨髓中的髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)。方法建立BALB/c小鼠原位肝癌移植模型,10d后分离荷瘤小鼠骨髓细胞,分别进行CD11b、Gr-1单色标记及CD11b和Gr-1双色标记后,进行流式分选。比较这三种方式分选的MDSCs纯度、活力,并检测分选的细胞精氨酸代谢酶1(arginase-1,Arg-1)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达,并通过活性氧检测试剂盒检测MDSCs活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达。结果三种方法分选到的细胞活力和纯度都大于90%。CD11b标记进行分选操作最为方便,易于统一,但纯度略差;Gr-1标记进行分选时,细胞群不好确定,但纯度高;双色标记进行分选纯度最高。分选的细胞高表达Arg-1、iNOS和ROS。结论三种抗体标记方法均能从小鼠原位肝癌模型骨髓中的分选到纯度高、活力好的MDSCs,而用CD11b单色标记操作方便,易于统一,可作为首选方法。MDSCs的成功分选,对于后续开展MDSCs的生物学和免疫学功能研究奠定了基础。     

神经系统小胶质细胞流式检测及分选

小胶质细胞是中枢神经系统中主要的免疫细胞,数量上占大脑的5%～10%。作为中枢神经系统的巨噬细胞,它们会不断清除中枢神经系统中的斑块、受损或不必要的神经元和突触以及感染因子。从中枢神经系统组织中分离小胶质细胞为研究基础细胞生物学和检测体内治疗对小胶质细胞免疫功能的影响提供了强有力的工具。该文描述了利用小胶质细胞特异性表面标志物,通过流式细胞分选(FACS)纯化小胶质细胞的方法。     

流式细胞仪分选转基因斑马鱼胚胎荧光标记细胞的一种快速方法

荧光蛋白在特异组织和器官表达的转基因斑马鱼已经在发育生物学和疾病模型研究中得到了广泛的应用。这些转基因系有助于追踪和分析数量较少的细胞群。但是如果要分离得到这些细胞来定量分析mRNA或蛋白质的表达情况比较困难。利用流式细胞仪分选这些荧光标记细胞是一种解决办法。此方法在不同的实验室中被广泛地应用。也有相关流程的介绍。但是流程一般较为繁琐,操作比较困难。该文以从转基因斑马鱼Tg（Kdrl：EGFP）中分选绿色荧光蛋白阳性的血管内皮细胞为例,介绍利用流式细胞仪分选转基因斑马鱼荧光标记细胞的实验流程和技术要点。该文作者在前人工作的基础上结合大量的实验经验．发展并优化了一套操作简便、效率较高的流程来分选这些细胞,在此做详细的介绍给大家以供参考。     

HRP与TMB显色用于流式细胞仪MoFlo Astrios~(EQ)单细胞分选的方法探索

该文应用流式细胞仪MoFlo AstriosEQ结合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)混合显色原理,进行单细胞分选的方法探索。结果显示:分选不同数量的微球或者细胞导致两者显色反应呈现深浅不一的蓝色,而未分选的对照组为无色, D650值提示组间具有显著性差异;分选微球和分选细胞组间无显著差异。研究表明,该方法能够快速判断实际分选得到的微球或细胞数与理论设置是否吻合,为后续单细胞分选提供判断依据。另外,整个验证过程不需要额外的大型仪器,试剂常规、廉价,可作为今后单细胞分选实验的辅助手段。     

基于流式细胞仪高通量分选的深海微生物单细胞培养

[目的]建立适用于海洋微生物的流式细胞分选与高通量单细胞培养的方法,通过该方法从印度洋深海样品中分离微生物纯培养菌株.[方法]利用流式细胞仪单细胞分选功能,以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光信号代替荧光信号作为分选逻辑,对深海水体和沉积物样品中微生物进行单细胞高通量分选和培养.[结果]确定了流式细胞分选的区域和...     

造血干细胞衰老体外模型构建及其生物学研究初探

造血干细胞（HSC）衰老与机体衰老密切相关。HSC衰老研究中的关键问题是HSC衰老模型的构建,迄今还未有公认的HSC衰老的体外模型,建立HSC衰老体外模型可为深入研究HSC衰老的生物学机理及调控机制奠定基础。本实验运用免疫磁珠分选法分离纯化小鼠Soft-1^＋ HSC,流式细胞术鉴定分选细胞的纯度达85％,免疫荧光示大量带绿色荧光Sca-1^＋细胞,     

心肌干细胞培养和纯化的实验方法研究

目的:探讨心肌干细胞(CSC)体外分离、培养和纯化方法,以建立重复性好、稳定性高的CSC培养的方法.方法:用不同的消化方法来分C57BL小鼠心脏组织中的细胞,将获得的细胞置于自行拟定的心肌干细胞培养液中培养.以c-kit、Sca-l和Sca-l/c-kit作为干细胞标记,用免疫磁珠法纯化细胞.用流式细胞仪、免疫荧光显微镜、激光共聚焦显微镜检测分选后所得细胞表面标记表达,并对比观察分选前后细胞生长情况,进一步了解CSC的生物学特性.结果:①从小鼠心肌组织中分离培养所得的细胞中,含有一种类似于文献报道中所提及CSC形态的细胞.②用免疫磁珠法可以分选出高纯度的CSC,实验中分选出CSC分别具有c-kit+-CD34-lin-、Sea-I+-CD34low-Lin-、Sea-1+c--kit+-CD34low-Lin-的表型.③分选后的干细胞经过1~2d的滞留期后,贴壁生长的细胞形态相对均一;而传代后细胞贴壁迅速,细胞形态多样.结论:从C57BL小鼠心脏中可以分离、培养获得CSC,并可用免疫磁珠法得以纯化.     

归芪多糖延缓衰老作用的研究

本文研究了归芪多糖对衰老小鼠的抗衰老作用。将50只小鼠分为5组,除正常对照组外其余各组均采用D-半乳糖(0.5 g·kg-1)皮下注射建立衰老小鼠模型,以不同剂量的归芪多糖(1 g/kg和0.5 g/kg)给小鼠连续灌胃42 d后,测定其血清中过氧化氢(H2O2)和皮肤组织中羟脯氨酸(Hyp)含量、大脑中单胺氧化酶(MAO)、肝组织中谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)和黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性。结果显示,归芪多糖能明显抑制小鼠血清H2O2含量、肝组织XOD和大脑MAO的活性(P<0.01);显著提高肝组织中GSH-PX的活性和皮肤组织中Hyp的含量(P<0.01)。证明归芪多糖可能通过降低衰老小鼠血清H2O2的含量、肝组织XOD和大脑MAO的活性,以及提高肝组织GSH-PX的活性和皮肤组织中Hyp的含量的机制起到一定的抗衰老作用。     

Tbx18+心外膜祖细胞参与成年小鼠部分心脏组织形成

转录因子Tbx18在胚胎心脏发育过程中起重要调控作用,是心外膜祖细胞标记之一|故以Tbx18为标记的阳性祖细胞群被称为：Tbx18+心外膜祖细胞(epicardial progenitor cells, EPCs)。小鼠胚胎、新生和成年期心脏组织细胞的特性区别较大,成年小鼠的心脏属于终末分化组织。但是,Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小尚存争议。本研究拟定量分析Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小。采用整体和组织切片X-gal染色检测成年心脏组织LacZ的表达|荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting,FACS)分离成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织EYFP+细胞。结果显示,在Tbx18+EPCs遗传谱系示踪小鼠,报告基因LacZ和EYFP在成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等处表达|成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织细胞用FACS分离,分选的EYFP+细胞比例平均约为33.94%。由此可见,成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等心脏组织均可来源于Tbx18+EPCs|约1/3成年小鼠心脏组织细胞来源于Tbx18+EPCs。故Tbx18+EPCs参与成年小鼠心脏组织的部分形成。     

两种免疫磁珠分离法分选小鼠骨髓粒-单核祖细胞的效率比较

摘要 目的：提取小鼠骨髓细胞（bone marrow cell, BMC）,用两种不同的免疫磁珠分离（magnetic activated cell sorting, MACS）试剂盒从小鼠BMC中分选提纯粒-单核祖细胞（granulocyte-monocyte progenitor, GMP）,比较这两种免疫磁珠的分选效率。方法：从小鼠股骨和胫骨中提取BMC,通过两种不同的MACS试剂盒,即Lineage阳性细胞清除试剂盒和CD117阳性细胞分选试剂盒,分别得到Lineage-细胞群和CD117⁺细胞群,用代表GMP细胞表面标志物的荧光抗体标记,孵育后通过流式细胞荧光分选技术得到GMP细胞,并且对比得到GMP细胞的效率。结果：每2只野生型C57BL/6J小鼠可共收集骨髓细胞（7.02±1.24）×10⁷个,细胞活力为（91.86±5.24）%。经过Lineage阳性细胞清除试剂盒得到的细胞数量为（5.71±2.86）×10⁶个;经过CD117阳性细胞分选试剂盒得到的细胞数量为（2.70±0.56）×10⁶个。Lineage磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为（10.90±1.37）%,CD117磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为（4.83±2.08）%。结论：Lineage阳性细胞清除试剂盒能更有效分选小鼠骨髓细胞中的粒-单核祖细胞。     

流式细胞分选装置的研制与发展

在自己研制的流式细胞仪上开发出了流式细胞分选装置。分选的方法是给含有目标细胞的液滴充电,使之在静电场中偏转。该装置有以下优点：由于全部电路由同一方波模式振动源驱动,液滴形成过程和充电脉冲产生过程完全同步;独特考虑的分选逻辑电路能识别细胞类型,自动调整充电脉冲宽度,能在保证高分选纯度的前提下获得更高的分选收获率和分选速度;在不应期里出现另一细胞时能予以处理。为了更好地使用分选装置,本文还从仪器角度和样品角度分析讨论了影响分选指标的因素。     

流式细胞计无菌分选功能的开发

分选技术是流式细胞计一项重要功能。其分离细胞的速度及纯度是目前世界上任何其他医学仪器无法比拟的。其分选速度可高达3000—5000个细胞/秒;纯度可高达99％以上。 分选可分为两种,一种为一般分选,另一种为无菌分选。无菌分选需要在分选过程中严格保证无菌条件,使分选过程中细胞不受污染。以利于细胞的继续增殖。一般分选,国内其他实验室正在开展;而无菌分选国内尚未见报道。国外也只是部分实验室在应用。我们参考了一些国内外文献并借鉴了一些国外经验,在FACS440型流式细胞计上开发了无菌分选功能。本文介绍这种方法及应用。希望此文对今后推广这项技术起到促进作用。     

1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在病原诊断方面具有重要意义。【目的】以纯化的重组PDCo VN蛋白为抗原,制备抗N蛋白的单克隆抗体并进行特性鉴定。【方法】利用已构建的p ET-28a-N表达菌,经IPTG诱导表达获得具有免疫原性的重组N蛋白,并将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,经3次亚克隆筛选,选取抗体效价最高的一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔并制备腹水单克隆抗体,利用Protein G亲和层析柱纯化。通过腹水单克隆抗体效价测定、抗体亚型鉴定、Western blot鉴定其特性;利用细胞间接免疫荧光试验、组织石蜡切片荧光试验、免疫组化、流式细胞荧光分选技术鉴定其诊断应用价值。【结果】经筛选后得到一株杂交瘤细胞命名为4E88,其腹水单克隆抗体效价为1:105,亚型为Ig G1型,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体与重组N蛋白和超速离心纯化的PDCo V全病毒反应形成特异性条带。此外,单克隆抗体4E88可以用于猪δ冠状病毒检测的间接免疫荧光试验、免疫组化染色和流式细胞荧光分选技术。【结论】研究获得的单克隆抗体4E88具有较好的反应性,为后续开展PDCo V鉴定、诊断和N蛋白功能研究等奠定基础。     

一种应用流式细胞术快速分选活的衰老细胞的方法

衰老细胞是细胞老化研究的重要模型,目前还缺乏从混合细胞群中分选活的衰老细胞的有效方法。该研究以1.0μg/m L顺铂诱导的人鼻咽癌CNE 2细胞衰老为研究模型,根据细胞大小和自发荧光(脂褐素积累)两项物理特征,采用FACS Aria III流式细胞仪在Purity模式下设门分选活的衰老细胞(SEN)和增殖细胞(PROL),收集细胞,再分别进行回测分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色验证。结果从SEN门控获得分选纯度为74.7%的活的衰老细胞,分选出的细胞可重新贴壁;其中,72.1%的细胞呈SA-β-gal染色阳性,与PROL门控分选获得的细胞(8.01%)相比较有显著差异(P0.01)。该研究提供了一种基于流式细胞仪快速分选活的衰老细胞的方法。     

用western blotting方法检测乙醇固定细胞中细胞周期素的表达

用western-blotting法测定乙醇固定细胞中细胞周期素（cyclin)的表达情况,探索western-blotting和流式细胞仪对固定细胞在流式细胞术分选前或分选后对同批标本进行蛋白同步分析的可行性,采用对数生长期的Molt-4细胞,经两种常规固定方法固定后,用western-blotting方法检测cyclinA,B1、D和E的表达,另取乙醇固定经流式细胞仪分选的G1期和G2/M期细胞裂解后,用western-blotting方法检测不同时相细胞中cyclinB1的表达。结果显示从固定细胞中提取的蛋白经western-blotting检测可得到清晰且分子量正确的条带,两种不同方法固定的细胞中检测到的cyclins表达未见明显差异。乙醇固定细胞经分选后提取蛋白行western-blotting检测可见G2/M期细胞的cyclinB1有明显表达而G1期细胞不明显。细胞进行固定,洗涤,染色和分选等处理后不影响western-blotting对其cyclins表达的分析。说明用western-blotting和流式细胞仪对固定细胞在流式细胞术分选前或分选后进行蛋白同步分析是可行的。