表观遗传药物对体细胞核移植胚胎发育的促进作用

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是利用卵母细胞胞质中的重编程物质对高度分化体细胞核进行重编程作用使其恢复全能性并发育为新个体的技术。在SCNT过程中,表观遗传修饰参与卵母细胞的重编程,如DNA甲基化修饰和组蛋白的翻译后修饰。这些重编程的异常修饰会对SCNT胚胎的发育产生不良影响。表观遗传药物,如DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰基酶抑制剂,可改善表观遗传修饰的异常现象,促进体细胞核移植重构胚的重编程。该文对SCNT胚胎重编程过程中的异常表观遗传修饰以及近年来报道的表观遗传相关药物进行综述,并进一步探讨了这些药物对SCNT胚胎发育的促进作用。     

桂科Ⅰ号成年公猪体细胞核移植胚胎的体外生产

目前,关于桂科Ⅰ号猪体细胞核移植胚胎体外发育的研究尚未见报道。本研究结果表明,桂科Ⅰ号成年公猪来源的皮肤成纤维细胞(adult boar fibroblast cell,ABFC)和刚出生小公猪来源的皮肤成纤维细胞(newborn boar fibroblast cell,NBFC)对体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎的体外发育没有明显影响;在体外环境培养下,一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂—Scriptaid(SCR)对桂科Ⅰ号公猪SCNT胚胎的囊胚率具有促进作用。研究进行3个实验,实验一结果表明,细胞呈现典型的成纤维细胞形态,且生长呈现S型;实验二结果表明,通过将ABFC与NBFC注射到去核的卵母细胞制作SCNT胚胎,ABFC和NBFC来源的桂科Ⅰ号公猪SCNT胚胎的融合率、分裂率、囊胚率和囊胚细胞数没有明显的差异(53.2%vs 61.7%,p0.05;72.3%vs 75.7%,p0.05;11.9%vs 11.7%,p0.05;60.7 vs 57.5,p0.05);实验三结果表明,通过500 nmol/L SCR处理ABFC来源的SCNT胚胎,与对照组相比,处理组的分裂率和囊胚细胞数没有明显的差异(82.6%vs 80.1%,p0.05;42.9 vs 41.4,p0.05);但添加500 nmol/L SCR的ABFC来源的SCNT胚胎的囊胚率明显比对照组的高(21.6%vs 11.5%,p0.05)。数据表明桂科Ⅰ号成年公猪体细胞可作为供体细胞生产克隆胚胎,并且在体外环境培养下,通过500 nmol/L SCR处理极大地提高克隆胚胎的囊胚率,本研究可为下一步生产存活的桂科Ⅰ号SCNT猪奠定基础。     

肺缺陷的体细胞核移植牛TTF-1 mRNA 的低表达与启动子区CpG 的甲基化无关

通过体细胞核移植技术获得克隆哺乳动物的种类在不断增加, 但成功率仍然较
低, 常表现为围产期的高死亡率. 其中, 肺发育异常是最常见的发育缺陷之一. 哺乳动
物肺器官的发生受一系列蛋白因子的调控, 其中隶属于同源结构域转录因子家族的
TTF-1 参与肺的发生和出生后功能的维持, 是一种重要的转录因子, 其表达水平的异常
很可能与肺的发育缺陷有关. SCNT 胚胎异常的甲基化可能影响发育关键基因的表达.
本研究克隆了牛TTF-1 基因, 包括启动子区(921 bp)、外显子1(373 bp)、内含子1(932 bp)
和外显子2 的一部分(273 bp)在内约2.5 kb 的核苷酸序列, 发现3 头肺发育有缺陷的
SCNT牛TTF-1 mRNA的表达量均显著低于肺发育正常的SCNT牛及对照牛(P<0.05). 对
表达量最低的个体和对照牛肺组织 TTF-1 基因启动子区63 个CpG 位点的甲基化状态进
行了分析, 发现在大多数位点上, 二者均处于去甲基化状态, 甲基化百分比差异不显著
(P>0.05), 说明肺发育缺陷的体细胞核移植牛TTF-1 mRNA 的低表达与启动子区CpG 的
甲基化无关.     

Scriptaid在猪体细胞核移植应用的研究进展

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)效率低下严重制约了克隆猪的产出,而在SCNT胚胎中表现出的表观遗传重编程(epigenetic reprogramming)不完全是导致该结果的重要原因。大量的研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi),如Scriptaid(SCR),能够修复克隆胚胎的表观遗传重编程状态,包括提高供体核组蛋白的乙酰化水平、促进重要转录因子的转录活性以及增强染色质重塑等,从而促进SCNT胚胎的发育。本综述在参阅国内外研究成果的基础上对SCR在猪克隆中的应用进行分析和论述,以期为进一步在克隆猪的生产实践中加以应用奠定基础。     

维生素C与体细胞核移植介导的重编程

维生素C (vitamin C,VC)是一种常见的天然小分子,可作为抗氧化剂在各种生化反应中发挥重要作用.近年来有研究发现,体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)胚胎的发育率在VC的存在下可以显著提高,其中一个重要的原因可能是VC参与了DNA和组蛋白的去甲基化,使供体细胞...     

利用改进的手工克隆技术生产转GFP基因猪克隆胚胎

通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用。文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本。首先将增强型绿色荧光基因(EGFP)导入猪胎儿成纤维细胞中,通过荧光观察EGFP的表达来筛选适合做细胞核移植的体细胞。这样避免了外源EGFP基因虽已整合至猪基因组但不表达的情况,保证供体细胞100%是表达目标蛋白(绿色荧光蛋白)的细胞;然后利用新一代体细胞核移植技术——手工克隆技术(Handmade cloning,HMC)将供体细胞与卵母细胞融合生产胚胎。共收集了4个批次378个肉用家猪的卵母细胞,经体外培养成熟后手工去核得到266个去核卵母细胞,与EGFP细胞融合后获得127个重构胚胎,将重构胚胎体外培养到144 h,得到转基因囊胚65个,平均囊胚率为52.1±8.3%。与传统SCNT相比,HMC不仅操作简便,而且能大幅提高核移植细胞的囊胚率。更为重要的是,改进的手工克隆技术摆脱了昂贵的显微操作仪,为产业化生产转基因动物提供了新的实用基础。     

Molecular Cell | 首次揭示SCNT胚胎早期发育过程中Cohesin对初级合子基因组激活相关基因表达的阻碍

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术可将体细胞重编程为全能细胞，但研究人员对这一过程中染色体3D构象的重塑却知之甚少。清华大学生命科学学院颉伟研究组与华中农业大学动科动医学院苗义良研究组通过少量细胞全基因组染色质构象捕获技术(sisHi-C)检测了小鼠SCNT胚胎和体外受精(in vitro fertilization, IVF)胚胎卵裂期染色体构象变化(2020年6月23日在线发表，doi:10.1016/j.molcel.2020.06.001)。研究发现胚胎在卵裂期发育过程中拓扑相关结构域(topologically associating domain, TADs)相较其供体细胞或MII卵显著减弱，但SCNT胚胎在1-细胞期TADs明显强于相应时期的体外受精胚胎，2-细胞期之后两种胚胎TADs的变化趋同，2-细胞期之后TADs减弱，至8-细胞期TADs重新增强。研究人员进一步在1-细胞期敲低了TADs关键蛋白Cohesin (黏连蛋白)，发现Cohesin敲低的SCNT胚胎1-细胞期TADs和对照组相比明显减弱，胚胎发育至囊胚的比例显著增加。转录组测序发现Cohesin敲低后的染色体构象变化促进了初级合子基因组激活相关基因的表达，从而促进了SCNT胚胎的体外发育。该研究结果表明染色体构象的异常可能是SCNT胚胎发育能力较IVF胚胎低的重要原因，为提高SCNT胚胎发育能力提供了新思路。     

GTL2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

体细胞核移植技术（SCNT）在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素．印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录．为了研究GTL2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对GTL2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对GTL2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析．研究结果表明：GTL2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,GTL2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一．     

DNA甲基化修饰与体细胞核移植的关系

成功的体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）有赖于供体细胞的基因组通过重编程恢复到支持胚胎发育的全能性状态。但是,相比起自然受精后发生的重编程来说,要诱导一个已经分化的供体细胞重编程为全能性状态,往往在时间上和程度上都是迟滞的和不完全的。同时,DNA甲基化状况又是影响克隆胚胎发育和基因表达的关键因素之一。因此,深入研究主导DNA甲基化修饰的分子机理,探讨DNA去甲基化在供体细胞重编程过程中扮演的角色,从而进一步提高供体细胞重编程效率,提高克隆胚的发育潜能,这对于体细胞核移植效率的提高具有重要的意义。     

初次卵裂时间是猪克隆胚胎发育潜能的重要标识

初次卵裂时间与哺乳动物胚胎发育潜能有关．比较了不同初次卵裂时间(20～24 h,早期;25～36 h,中期;37～48 h,晚期;20～48 h,对照)的猪孤雌(parthenogenetic,PA)、体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎的囊胚发育率、扩张囊胚发育率和囊胚细胞数,评价其体外发育能力．发现早期卵裂的PA胚胎发育到第6天的囊胚发育率显著高于中期、晚期以及对照组(P < 0.05;54.0% vs. 19.6%,5.4%,18.7%)．扩张囊胚发育率,早裂胚胎同样优于其他组．早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6天的囊胚比率高于中期卵裂胚胎(32.2% vs. 23.5%),而晚期卵裂胚胎发育到囊胚的比率最低(6.3%)．早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6天的扩张囊胚比率显著高于其余各组 (P < 0.05;18.9% vs. 5.9%、3.1%、7.4%)．囊胚细胞数在早期、中期、晚期三组之间表现出下降趋势．将早期卵裂的SCNT胚胎与未经挑选的对照组胚胎分别进行移植,观察其体内发育能力．移植早裂SCNT胚胎的受体在产仔数和克隆效率上均明显高于未经挑选胚胎的受体(4.7 vs. 2.1;3.9% vs. 0.9%),说明早裂胚胎着床后具有更强的发育能力．以上结果表明：初次卵裂时间可以作为猪克隆胚胎发育潜能的重要标识,选择早裂的胚胎进行移植,有助于提高克隆效率．     

哺乳动物体细胞核移植表观遗传重编程研究进展

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依然很低,严重限制其在畜牧业和生物医学上的应用。导致克隆胚胎发育效率低的主要原因是体细胞重编程错误或重编程不完全,主要表现为:印记基因Xist表达异常、DNA甲基化异常,组蛋白修饰异常等。本文简要介绍了体细胞核移植技术,系统总结了哺乳动物克隆胚胎发育效率低的主要影响因素,以期为提升体细胞克隆效率相关研究与实践提供理论参考。     

野生动物种间体细胞核移植研究进展

种间体细胞核移植 (Interspecies somatic cell nuclear transfer, iSCNT) 作为体细胞核移植 (Somatic cell nuclear transfer, SCNT) 中极具潜力的研究方向之一,在转基因动物的生产、优良种群的繁育、濒危动物的保护、灭绝物种的“再生”以及野生动物繁育和生物多样性保护等方面具有广泛的应用前景。本文通过对猫科、犬科、牛科、猪科和西貒科等野生动物的种间核移植技术的研究进展和技术屏障进行阐述,为促进iSCNT技术在野生动物繁殖、育种和多样性保护等方面的进一步应用提供理论基础和技术指导。     

哺乳动物手工克隆的研究进展

体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)基本上分为传统克隆(Traditional cloning,TC)和手工克隆(Handmade cloning,HMC)。虽然随着SCNT的推进,科研人员已经利用TC成功克隆出多种动物,但这种方法需要使用昂贵的显微操作仪,并且克隆效率较低。因此,TC逐渐被新方法HMC替代,HMC是一种通过手工操作将体细胞与两个去核的半卵母细胞融合、激活,并在培养系统中培养后产生胚胎的方法。HMC不仅操作程序简单、不需要显微操作仪、成本较低,还可以提高囊胚率,使克隆技术向生产应用又迈进了一大步。主要对HMC的操作程序、表观遗传重编程异常和HMC重编程异常修复进行了综述,并对HMC进行了展望,以期能够更好地将其应用到生产中去。     

体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而, 体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平, 主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编程, 包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因组印记、X染色体失活和端粒长度等修饰出现的异常。使用一些小分子化合物以及Xist基因的敲除或敲低等方法能修复表观遗传修饰错误, 辅助供体核的重编程, 从而提高体细胞克隆效率, 使其更好地应用于基础研究和生产实践。文章对体细胞核移植后胚胎发育过程中出现的异常表观遗传修饰进行了综述, 并着重论述了近年来有关修复表观遗传错误的研究进展。     

研究揭示线粒体基因缺陷改造新策略

<正>最近,一项研究称,线粒体mtDNA突变可以通过遗传获得的方式来纠正,正常代谢功能可以通过多能干细胞来恢复。利用线粒体DNA突变患者皮肤中的成纤维细胞,通过细胞因子介导的重编程(iPS细胞)和体细胞核转移(SCNT)这两种方法,科学家可以获得相关的多能干细胞,最后可以恢复这些细胞线粒体的正常代谢功能。这种针对携带线粒体突变细胞,得到多能干细胞或者诱导多能干细胞的方法,有望用于针对下一代的基因改造,使得女性患者的后代免遭这种线粒体突变带来的疾病的困扰。     

重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。     

克隆哺乳动物的胎盘发育缺陷

克隆又称体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT),该技术已在多种哺乳动物中成功建立并被逐渐应用。然而,利用该技术获得的哺乳动物克隆胚胎的发育效率非常低(一般只有1%~5%),这严重限制了克隆技术的应用。胎盘发育缺陷被认为是抑制克隆胚胎发育的一个主要原因。几乎所有的SCNT来源胎盘都会出现不同的发育缺陷,如胎盘增生、胎盘血管缺陷、脐带畸形等。胎盘异常的根本原因是滋养层细胞基因组在发育过程中未能建立正确的表观遗传修饰,导致胎盘发育调控相关的重要基因,特别是印迹基因的表达出现异常。印迹基因表达异常导致胎盘的形态异常和功能缺陷,进而影响克隆胚胎的发育能力。目前,虽然有许多提高克隆胚胎发育能力的研究报道,然而在大多数研究中克隆效率并没有得到大幅度的提高,主要原因之一是克隆胚胎的胎盘发育仍然存在诸多缺陷。本文综述了克隆哺乳动物的胎盘异常及其印迹基因表达,并对未来提高克隆效率的研究提出展望。     

Association between mitochondrial DNA haplotype compatibility and increased efficiency of bovine intersubspecies cloning

Reconstructed embryos derived from intersubspecies somatic cell nuclear transfer(SCNT) have poorer developmental potential than those from intrasubspecies SCNT.Based on our previous study that Holstein dairy bovine(HD) mitochondrial DNA(mtDNA) haplotype compatibility between donor karyoplast and recipient cytoplast is crucial for SCNT embryo development,we performed intersubspecies SCNT using HD as donor karyoplast and Luxi yellow heifer(LY) as recipient cytoplast according to mtDNA haplotypes determined...     

体细胞核重编程中表观遗传学的研究进展

促使体细胞核重编程的方法很多,除了传统的体细胞核移植方法外,科学家们努力寻求从法律、道德、伦理等方面更易被人们接受的新方法.近年来多能干细胞与体细胞融合、多能细胞的抽提物与体细胞共孵育以及将编码多潜能因子的基因导入体细胞中等方法都能使体细胞核发生重新编程,将已分化的体细胞转变为一种全能的胚胎状态.主要论述了生殖细胞及早期胚胎、体细胞核移植和其他形式的体细胞核重编程的表观遗传学的改变,对表观遗传学的深入研究将有助于我们进一步了解体细胞核重编程的机制,从而不断完善各种技术促进供体核的重新编程,使其更好地应用于基础研究和生产实践.     

Generation of cloned calves from different types of somatic cells

Remarkable progress has been made in animal cloning research since the first mammal was success-fully cloned[1], and the technique of SCNT is now widely used in biological studies. In theory, successful development of live offspring from SCNT embryos demonstrates that a fully differentiated somatic cell can be reprogrammed and restore its totipotency; in practice, animal cloning can be applied for duplication of elite animals, production of transgenic animals, rescue of endangered species …