鉴定小鼠胚胎性别的染色体标本制作方法研究

通过制备７２６４枚小鼠胚胎的染色体标本并鉴定其性别的试验,获得了理想的实验参数。采用理想的实验参数,制作和鉴定了２４２枚小鼠晚期桑椹胚、囊胚和扩展整胚的染色体标本及其性别,性别鉴定成功率分别为８０．４％、９９．０％和９４．５％。     

山羊体外受精胚性别鉴定不同取样方法的研究

为了不断完善山羊早期胚胎性别鉴定技术,实现奶山羊雌性胚胎的体外生产与商业化,本研究对胚胎性别鉴定的两种采样方法进行比较。结果表明,两种取样方法性别鉴定结果的准确性没有差异,桑椹胚经打孔法采样后胚胎妊娠率(36．84％)明显高于切割法(31．25％),囊胚经切割法采样后胚胎妊娠率(31．58％)明显高于打孔法(23．53％),综合比较,胚胎性别鉴定应以打孔法采集早期桑椹胚为宜。     

体外重组的人促黄体素对小鼠早期胚胎发育的影响

为了研究人的重组促黄体素（r-hLH)对小鼠早期胚胎发育的作用,我们用一定剂量的r-hFSH(人促卵泡素,20IU）结合不同剂量的r-hLH（0－20IU）,或先与不同剂量r-hLH配比（5－20IU）,再与一定剂量,r-hLH（15IU）结合,对性成熟前的小鼠进行超数排卵;并对从其输卵管冲出的早期胚胎进行体外培养,通过观察这些早期胚胎体外发育情况,再与PMSG－hCG超排小鼠的早期胚胎体外培养结果进行比较。我们发现用重组激素处理的性成熟前小鼠,无论在平均冲胚数或桑囊率,囊胚率上,都以结合r-hLH或配比r-hLH的剂量为15IU时最好,但各重组激素处理组在桑囊率和囊胚率上都极显著低于PMSG－hCG对照组的相应指标。上述结果表明,r-hLH对小鼠早期胚胎的发育（尤其是囊胚的形成）有明显的抑制作用,且与r-hLH呈一定的剂量依赖性关系。     

利用静电场提高IVF小鼠胚胎发育率的研究

本研究首先用静电场处理小鼠2细胞期胚胎,通过观察其发育率筛选了最佳处理剂量(场强和时间),在此基础上探讨了不同细胞期的静电刺激对小鼠胚胎发育的影响。结果表明:用静电场处理小鼠2细胞期胚胎,能显著提高胚胎的发育能力,最佳处理剂量的囊胚率从42.4％提高到64.5％,囊胚孵化率从20.0％提高到44.8％,与对照组存在极显著差异(P<0.01)。不同细胞期胚胎对静电刺激的敏感性不同,其中1细胞(授精后6h)和2细胞期(授精后24h)胚胎对电场刺激较为敏感。     

运用PCR对小鼠植入前胚胎进行性别诊断

根据C57BL6小鼠Y染色体重复序列145C5的碱基顺序,设计并合成一对引物,运用PCR扩增昆明白小鼠入前胚胎卵裂球DNA,以确定其性别,共对108枚活检胚胎的相应卵裂球进行了性别诊断,获雄性胚46枚,雌性胚62枚,移植后分别获雄性仔鼠4只,准确率100％（4／4）,雌性仔鼠9只,准确率70％（9／13）,本研究结果表明小鼠Y染色体重复序列145C5的碱基顺序在C57BL6小鼠和昆明白小鼠中基本一致,为农牧业动物进行性别选择和运用PCR进行单基因病植入前遗传学诊断提供了方法学基础。     

免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞

目的　使用免疫外科法分离克隆BALB c小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ES细胞 ) ,为进一步建立BALB c小鼠ES细胞系打下基础。方法　用免疫外科法从 4 5枚BALB c小鼠囊胚中分离得到 2 0枚去除滋养层细胞的ICM ,接种在MEF饲养层上 ,使用DMEM(高糖 ) 15 ?S 0 1mmol Lβ 巯基乙醇 0 0 1mmol L非必需氨基酸 10 0 0IU mlLIF 10 0IU mL青霉素 10 0IU ml链霉素培养液 ,17枚形成典型的ICM集落 (85 0 % ) ,有一枚胚胎传至第 10代。用于全胚培养的BALB c小鼠胚胎共 10 2枚 ,使用与免疫外科相同的培养方法 ,6 6枚形成典型的ICM集落 (6 4 7% ) ,其中一枚胚胎传至第 8代。结果　免疫外科法较全胚培养法有利于小鼠ES细胞的分离与克隆 ;添加LIF(10 0 0IU ml)有利于小鼠ES细胞的分离与传代 (P <0 0 5 ) ;0 0 5 %胰酶 0 0 0 8?TA是较好的ES细胞消化液 ,对细胞综合损伤力小 ,且传代后ES细胞集落形成能力也较高 (P <0 0 5 )。结论　分离得到的ES细胞经形态学观察 ,AKP染色 ,体外分化实验 ,核型分析等证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。     

小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式

利用小鼠抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)单克隆抗体检测了体外培养小鼠四倍体早期胚胎的基因组甲基化模式。结果表明: 利用电融合方法制备的小鼠四倍体胚胎在体外培养体系中经历细胞质融合、细胞核融合及细胞继续分裂发育直到囊胚期的过程, 在细胞质融合的时候胚胎卵裂球同体内体外培养二倍体胚胎一样, 呈现高度甲基化状态; 在细胞核开始融合的时候, 甲基化水平急速下降, 在细胞核完全融合的时候甲基化水平达到最低点; 随着胚胎继续分裂, 胚胎甲基化水平逐渐增加, 在桑葚胚期甲基化水平最高; 但是囊胚期四倍体胚胎内细胞团同滋养层细胞甲基化荧光信号没有差别, 这与体内体外培养二倍体囊胚内细胞团细胞甲基化荧光强度高于滋养层细胞甲基化荧光强度不同。因此, 小鼠体外培养四倍体胚胎的甲基化模式是不正常的, 这可能是四倍体小鼠难以发育到妊娠足月的原因之一。这是对小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式的首次报道。     

应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索

提高解冻胚胎的发育能力和简化冷冻解冻程序是胚胎冷冻研究的两大永恒的主题。尽管乙二醇（EG）广泛用于家畜胚胎冷冻,但很少用于冷冻小鼠和人胚胎。为数很少的以EG慢冻小鼠或人胚胎的研究均采用较为复杂的人胚冷冻程序,未见简化程序和用EG冷冻小鼠桑椹胚的报道。采用简单的牛胚胎冷冻程序研究了发育时期、EG浓度、平衡方法、添加蔗糖以及解冻后脱除EG等对小鼠胚胎冻后发育能力的影响。结果显示：（1）致密晚期桑椹胚冻后体外培养囊胚发育率（81.92%±2.24%）和孵出率（68.56％±2.43%）显著（P＜0.05)高于4-细胞、8-细胞胚胎和致密早期桑椹胚胎;（2）1.8mol/L EG冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的囊胚发育和孵出率显著高于其它浓度;（3）在EG中平衡10min的冻后囊胚发育显著好于平衡5、20或30min;（4）两步平衡冷冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于一步平衡;（5）用EG冷冻小鼠胚胎无需添加蔗糖;（6）解冻后可不脱除EG;（7）冻后发育的早期囊胚和囊胚细胞数明显少于体内发育胚胎。因此,用EG冷冻小鼠胚胎的最佳方案为：致密晚期桑椹胚用1.8mol/L EG不添加蔗糖、两步平衡15min、以简单的牛胚胎冷冻程序冷冻解冻、解冻后不脱除EG直接培养或移植。     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

提高人胚胎干细胞建系率的优选培养体系与方法

目的:建立一种从废弃胚胎中提高囊胚形成率和质量的培养体系,寻找多种促进内细胞团(ICM)数目增多、贴壁、增值的方法,提高人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)建系效率,建立人胚胎干细胞库。方法:将179枚IVFDay3废弃的胚胎放入优选培养体系中培养(G2.5培养液中添加10%人血清蛋白,人白细胞抑制生长因子(hLIF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))。到Day7将形成的囊胚全部用机械法分离ICM,接种于丝裂霉素C灭活处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上,培养8-9天,每4-5天传代1次。结果:优选培养体系的囊胚形成率为29.1%(52/179),其中A级囊胚形成率为11.2%(20/179),50个ICM贴壁生长,20个出现克隆形态,成功建立11株hESC(FY-hES-11至FY-hES-21)。11株hESC均具有共同的多能性生物学特性。结论:优选培养体系可以明显提高囊胚形成的质量,促进ICM的增值,纯熟的机械切割法可以避免损伤ICM并提高其贴壁率,原代灭活的MEF饲养层可以明显促进细胞增殖。