金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

葡萄球菌A蛋白

金黄色葡萄球菌的细胞壁含有三种主要成份:核糖醇磷壁酸、粘肽及A蛋白(SPA)。因A蛋白具有能与免疫球蛋白的Fc段相结合的特性,已广泛应用于细菌、病毒等病原诊断、分型(如肺炎双球菌和链球菌的分型)、免疫球蛋白提取和测定、细胞的分离、分析淋巴细胞表面结构及免疫理论研究等方面,并具有广泛的应用前途。     

葡萄球菌A蛋白基因

<正>金黄色葡萄球菌A蛋白是一种细胞膜成分,据报道分子量约为42000。此蛋白有伸展的形态,而且顺序分析已揭示出在其分子中有两个功能独特区。N-端分子量为27000,由四种连续的高度同源的IgG结合单位组成,每一单位分子量大约7000。C-端分子量为15000,是一个能共价结合多糖肽而无结     

金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对小鼠体内肉瘤抑制效果

以实验室建立的$180小鼠肿瘤模型为研究对象,采用腹腔注射给药,观察葡萄球菌肠毒素A（SEA）在体内抑制肿瘤的效果。实验表明,SEA抑肿瘤率为40．18％,显示对肿瘤有一定的抑制作用;能显著刺激脾脏细胞增殖,使脾指数升高至11．3mg/g;使血清和脾组织中IL-2水平分别升至69．77pg/mL和682．43pg/mL;且能诱导肿瘤组织中产生大量的CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞。结果显示,SEA在机体内对免疫功能有正向调节作用,从而在一定程度上抑制了肿瘤细胞的生长。     

用生物素标记的葡萄球菌蛋白A(SPA)检测日本脑炎抗体

<正>自从亲和素和生物素特异性相互反应由Guesdon(1979)引入ELISA以来,此方法已被广泛采用为一种有用的技术,以检测和定量免疫球蛋白或抗原。用生物素标记的抗猪免疫球蛋白(Ig)抗体,结合酶标记亲和素结合物的ELISA,也已成功用到作者     

含A蛋白葡萄球菌的变异及分泌型A蛋白

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A或SpA)由于能与大多数哺乳动物血清IgG发生假免疫反应(Pseudoimmune reaction),产生非特异性结合而受注目。自1958年Jensen的工作开始,SpA的研究已有近三十年的历史。作为一种免疫化学试剂SpA已广泛应用于各种免疫学检测技术,IgG及其亚类纯化技术及组织化学研究等方面;在临床方面,SpA在肿瘤治疗上的初步结果令人鼓舞。近年来,一些研究者致力于SpA的变异研究,开拓了SpA研究的新领域,为     

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,SPA)分泌型融合表达系统

金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＡ,ＳＰＡ）分泌型融合表达系统李节,邱平（南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室,南京２１０００８）引言十几年前,我们制备蛋白质的方法还主要依靠从天然组织或细胞中提取,而现在人们可以通过基因工程方法,在细菌中生产大量有价值的活性蛋白和多肽。外源基因在细菌中表达的一个主要问题是基因产物如何折叠成天然构象。     

葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种黏连蛋白.经过几十年的研究,由于其对免疫球蛋白IgG的亲和特性,SPA已作为一种工具在抗体的检测、纯化以及疾病诊断中得到了广泛应用.SPA衍生物的构建适应了现代生产的需要,改造后的SPA可以与多种报告分子相偶联,使得免疫诊断更加快速准确.本文综述了SPA基于其免疫学特性,在抗体纯化和现代免疫分析应用中的发展状况及前景.     

用竞争性ELISA方法测量葡萄球菌蛋白A和价测携带蛋白A的葡萄球菌菌株

<正>引言 葡萄球菌蛋白A(SPA)在组织免疫学和血清学方面已经成为广泛使用的工具。大多数致病性金黄色萄萄球菌产生萄萄球菌蛋白A。线形的SPA多肽链与细胞壁共价结合,有些缺乏细胞结合SPA位点的金黄色葡萄球菌菌株变种大量产生细胞外SPA,而具有麦面SPA的菌株释放可溶性细胞外SPA: 使用ELISA类心法做为葡萄球菌肠毒     

SpA蛋白与磷脂单分子膜相互作用的研究

利用石英表面沉积ＬＢ膜的紫外吸收特性与ＣＤ谱特性研究了磷脂单分子膜与ＳｐＡ的相互作用,实验结果表明,单分子膜的疏密状态,蛋白质与膜表面的电荷特性及亚相Ｃａ＾２＋离子浓度均对该蛋白质与磷脂的相互作用有显著的影响,蛋白质在磷膜中的镶嵌与吸附作用为生物膜的重组提供了新的途径。     

金黄色葡萄球菌A蛋白基因的克隆及序列分析

 我们构建了金黄色葡萄球菌Cowan1株(CMCC26111)的染色体文库,转化大肠杆菌后筛选出一株protein A的阳性克隆。SDS-PAGE及Western-blot结果显示该克隆株表达的重组protein A的分子量为30 000,较天然protein A的小。该克隆中的protein A基因片段的序列分析表明,它含有天然protein A基因的启动子、信号肽以及至少四个与IgGFc段结合的结构域,而不含天然protein A的胞壁结合区,并发现其中有24个碱基对与Uhlen报告的protein A基因不同,由此导致三个编码的氨基酸发生变化,但这些差异并不影响该重组protein A与IgG Fc段的特异结合。     

M受体亚型与G蛋白

５种不同的Ｍ受体亚型的基因已被克隆，用免疫沉淀法观察了它们在体内的分布；Ｇ蛋白调节许多膜受体介导的细胞内功能，在牛的中枢神经系统中发现至少有５种独立的Ｇ蛋白，且每种Ｇ蛋白都由３个亚基构成。实验表明，５种Ｍ受体亚型通过不同的Ｇ蛋白，可同时与ｃＡＭＰ改变和ＰＩ翻转发生偶联作用。     

含A蛋白金黄色葡萄球菌菌株比较和培养基的选择

自发现金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)借Fc段与I_gG结合的功能以来,除用协同凝集和吸收试验作受检细菌或病毒分型、检出I_gM、I_gA抗体以外,还结合A蛋白同位素或荧光素标记、A蛋白标记红细胞或标记塑料平皿等技术,广泛用于微生物学、免疫学以及细胞表面抗原分析等方面的实验研究。这些研究均需SPA菌液或纯品A蛋白。近年来,我们在自制SPA菌液过程中,就不同菌株和培养基作了一些比较试验。现将比较结果报道如下。     

抗金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的原核表达及蛋白纯化

旨在将来源于鸡的金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)进行原核诱导表达,获得有抗体活性的目的蛋白。构建含有目的抗体基因的重组质粒,将此质粒进行原核诱导表达并鉴定所获得蛋白的生物活性。结果显示,(1)成功构建了含有金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的重组质粒p Cold I-scFv,质粒成功转化到大肠杆菌表达菌株中;(2)经过诱导表达后,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中;(3)使用4 mol/L尿素成功地将包涵体变性溶出;(4)通过柱层析法及透析法获得了纯化及复性效果较好的目的蛋白;(5)间接ELISA鉴定证实所获蛋白具有金黄色葡糖球菌抗体活性。通过质粒构建及原核诱导表达、包涵体溶出和复性等步骤,最终获得了有金黄色葡萄球菌抗体活性的目的蛋白。     

固定含A蛋白的葡萄球菌作为固相免疫吸附剂

<正>序言 金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)在免疫技术中已经成为一种重要的试剂,这是由于它和大多数哺乳类动物的免疫球蛋白(主要是IgG)能相互作用。甲醛固定金葡菌提供了一个有用的SpA固相结果物,能和IgG相互作用,持续数月不受影响。开始,这个试剂借协同凝集试验用于细菌血清学分群,但是目前,它更常被作为一种固相抗IgG的试剂用于放射免疫试验及细胞膜抗原的免疫沉淀反应。根据淋巴细胞表面抗原不同,金葡菌也能用于细胞检测和分离,也可以作为一     

中国首例人类免疫缺陷病毒(HIV-1)A亚型毒株的鉴定

中国首例人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）Ａ亚型毒株的鉴定苏玲邢辉羊海涛１罗小光２邵一鸣（中国预防医学科学院艾滋病参比实验室,北京１０００５０）关键词人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）,艾滋病（ＡＩＤＳ）,亚型,套式聚合酶链式反应（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）,序列分...     

葡萄球菌B型肠毒素突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)对小鼠的免疫保护作用

目的:评价葡萄球菌B型肠毒素(SEB)突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)作为超抗原疫苗候选分子对小鼠的免疫保护作用。方法:制备具有一定纯度和活性的突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)样品,灭活后免疫BALB/c小鼠,待小鼠抗体水平上升后,再以野生型SEB(wt-SEB)攻击用D-半乳糖胺致敏的BALB/c小鼠,评价该突变体蛋白的免疫保护作用。结果:突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)在重组大肠杆菌DH5α中得到表达,主要以包涵体形式存在,经变性、复性、SephacrylS200凝胶过滤,制备成较高纯度(95%)的、具有与wt-SEB相同抗原性的突变体蛋白样品,甲醛灭活后免疫BALB/c小鼠至4周,ELISA法测定小鼠抗体效价水平可达106;进而以wt-SEB攻毒,在达8倍LD50的攻击下,阴性对照小鼠在24h内全部死亡,而SEB(Y89A,C93S,Y94A)组与wt-SEB组小鼠至48h仍有存活。结论:突变体蛋白的保护效果与wt-SEB相类似,有望成为SEB减毒疫苗候选分子。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的B细胞表位的预测

目的预测金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白（SEA）的B细胞表位。方法以金黄色葡萄球菌合肥乳源分离株M3基因组DNA为模板,PCR扩增SEA基因并进行序列测定与分析。应用DNAstar protean软件对SEA蛋白的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等多参数进行综合分析,预测其B细胞表位。结果M3分离株的SEA基因全长774bp,编码由257个氨基酸组成的相对分子量为29．67kDa的SEA蛋白,M3分离株SEA基因与标准株的核苷酸序列与氨基酸序列同源性分别为98．7％和98．4％。SEA蛋白的优势B细胞表位位于肽链的第64—68、100～107、138—141、156—160、166～173、213～217和237～244区段。结论预测出SEA蛋白的7个优势B细胞表位,为进而克隆表达表位蛋白,制备针对SEA表位的单克隆抗体奠定了基础。