家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B₆在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5′-phosphate, PLP）是维生素B₆的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法对家蚕 Bombyx mori 的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1, siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase, SerB）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase, AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1, siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中SerB和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和SerB基因及AST基因存在联动调节关系。     

家蚕体内维生素B6的存在形态和转换代谢

采用不含桑叶粉末、以去维生素牛乳酪蛋白为蛋白源的准合成饲料饲育家蚕Bombyx mori幼虫,探讨了家蚕体内维生素B（VB₆）化合物的存在形态和转换代谢途经。随饲料中盐酸吡哆醇（PN-HCl）添加量的增加,幼虫体内吡哆醇(PN)含量相应变化,其次是吡哆醛(PL);而辅酶型磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)含量存在稳定性。饲料中的吡哆醇以单纯扩散的形式进入体液;体液中的吡哆醇被各种组织吸收后,在各自的吡哆醛激酶和PNP/磷酸吡哆胺氧化酶的作用下,转变成辅酶型磷酸吡哆醛。家蚕不同于哺乳动物,没有特定的辅酶型磷酸吡哆醛形成组织和辅酶型磷酸吡哆醛的转送机制。同时家蚕体内缺乏具储存VB₆功能的辅酶型磷酸吡哆醛结合蛋白,推测这是用缺乏VB₆的饲料饲育各龄起蚕,幼虫当龄死亡的主要原因。     

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2 的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。     

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK, EC2.7.1.35）是维生素B₆关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA (GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

家蚕吡哆醛激酶的融合表达与纯化

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK, EC 2.7.1.35）是维生素B6的关键代谢酶。本研究原核表达家蚕Bombyx mori重组PLK, 为进一步开展家蚕PLK的催化作用机制和表达调控机制的研究奠定基础。【方法】构建家蚕PLK基因融合表达质粒, 转化大肠杆菌Escherichia coli诱导表达, 经Ni²⁺ 亲和层析纯化后, 对融合蛋白的催化活性进行分析。【结果】纯化后的家蚕重组PLK经SDS-PAGE鉴定为单一条带, 比活力为1 800 U/mg, 纯化倍数为40倍。在底物过量的条件下, 该重组酶的体外最适反应温度是50℃; 最适pH为5.5~6; Zn²⁺ 是酶促反应有效的激活剂。【结论】重组家蚕PLK与来源于家蚕组织的PLK具有相同的催化性质。     

植物维生素B_6从头合成与代谢转换研究进展

维生素B6是一组可相互转换的吡啶衍生物的总称,包括吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醛。其中,磷酸吡哆醛是140多种细胞酶的辅酶。至今发现两种VB6从头合成途径,DXP(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸)依赖途径和DXP非依赖途径,前者仅存在于大肠杆菌和少量其他细菌,后者存在于其他所有VB6自养生物。除了VB6的从头合成,所有细胞生物体内还存在一条相似的补救途径,补救途径实现VB6各型的代谢转换。该文对近年来国内外有关植物VB6从头合成和代谢转换研究进展进行综述。     

家蚕吡哆醛激酶基因定点突变及突变体功能

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）是维生素B₆关键代谢酶。前期研究克隆出家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶cDNA,经序列比对发现几个重要且保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕吡哆醛激酶分子若干特定位置上氨基酸残基在酶功能上的作用进行本研究。【方法】采用重叠延伸法对家蚕吡哆醛激酶Thr⁴⁷,Asn¹²¹, Ile⁵⁴, Arg⁸⁸和Trp²³⁰氨基酸残基进行定点突变, 构建表达载体pET-22b（+）-PLK并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中进行诱导表达,经亲和层析对重组蛋白进行纯化, 通过酶活性检测进行功能鉴定。【结果】家蚕吡哆醛激酶Thr⁴⁷,Ile⁵⁴和Arg⁸⁸氨基酸突变后酶的催化活力分别下降82%, 58%和85%;Asn¹²¹突变对酶的催化活力几乎没有影响;而Trp²³⁰突变导致酶丧失催化活性。【结论】本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕吡哆醛激酶催化功能上的意义。     

茶树CsPLK基因的鉴定与表达分析

茶树中富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱等重要功能成分,具有较高的价值功效,茶树在生命周期中经常遭受逆境胁迫,维生素B6(VB6)在植物体内参与逆境应答,吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是VB6补救途径中的关键酶。为进一步了解PLK在茶树生物合成中的功能和作用机理,该研究基于茶树基因组数据库,以龙井43为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法从茶树中克隆出CsPLK的基因。结果表明:该基因序列长为1 179 bp,编码393个氨基酸; CsPLK蛋白和已知物种中PLK蛋白具有较高的同源性,都是核糖激酶超家族成员;通过构建pET-CsPLK载体进行原核表达,并鉴定出重组蛋白有很强的催化活性;组织表达特异性分析表明,叶中的表达量比茎、根的高,在根中最低;荧光定量PCR表示,低温诱导CsPLK上调表达,干旱诱导CsPLK下调表达,发现该基因在茶树中有明显的逆境应答,推测CsPLK在茶树的生长发育、逆境胁迫发挥重要作用。     

微嗜酸寡养单胞菌中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox生物学功能研究

【目的】研究微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox(phosphopyridoxamine oxidase,pnpox)在维生素B6(VB6)合成中的贡献及对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的降解活性。【方法】采用基因插入突变方式,对菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox进行突变,得到突变菌株。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测突变株对AFB1的降解活性,以及突变株中吡哆醇和吡哆醛的合成情况,确定基因pnpox在寡养单胞菌体内VB6合成中的贡献和黄曲霉毒素降解代谢作用。【结果】成功构建了磷酸吡哆胺氧化酶基因突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB,突变子吡哆醛的合成量较野生型菌株显著减少,吡哆醇合成量与野生型菌株无显著性差异;同时,突变子与野生型株CW117对AFB1的降解活性未发现显著性差异。【结论】菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶在吡哆醛合成的过程中起着重要作用,该基因突变会导致VB6的严重缺乏,影响寡养单胞菌正常生长,但该基因对CW117降解黄曲霉毒素无显著性贡献。     

微嗜酸寡养单胞菌中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox生物学功能研究北大核心

【目的】研究微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox(phosphopyridoxamine oxidase,pnpox)在维生素B6(VB6)合成中的贡献及对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的降解活性。【方法】采用基因插入突变方式,对菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox进行突变,得到突变菌株。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测突变株对AFB1的降解活性,以及突变株中吡哆醇和吡哆醛的合成情况,确定基因pnpox在寡养单胞菌体内VB6合成中的贡献和黄曲霉毒素降解代谢作用。【结果】成功构建了磷酸吡哆胺氧化酶基因突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB,突变子吡哆醛的合成量较野生型菌株显著减少,吡哆醇合成量与野生型菌株无显著性差异;同时,突变子与野生型株CW117对AFB1的降解活性未发现显著性差异。【结论】菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶在吡哆醛合成的过程中起着重要作用,该基因突变会导致VB6的严重缺乏,影响寡养单胞菌正常生长,但该基因对CW117降解黄曲霉毒素无显著性贡献。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

外源激素处理后家蚕吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶转录水平的变化

【目的】研究家蚕 Bombyx mori 经蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20-E)和保幼激素类似物(juvenile hormone analogue, JHA)处理后引起吡哆醛激酶(pyridoxal kinase, PLK)和磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine-5′-phosphate oxidase, PNPO)的转录水平变化,为进一步研究激素对蚕体营养代谢等工作奠定基础。【方法】以20-E和JHA分别喂食不同发育时期(5龄第1, 3和5天)的家蚕幼虫,以喂食蒸馏水的家蚕为对照,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)方法在处理后24 和48 h对各组幼虫后部丝腺中PLP合成酶PLK和PNPO的转录水平进行分析。【结果】5龄第1天幼虫经20-E处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现上调且与对照的差异达到极显著 (P＜0.01);5龄第3天幼虫经20-E处理,PLK的转录水平在48 h出现下调且与对照的差异达到显著(P＜0.05),PNPO的转录水平在24 和48 h均出现上调且与对照的差异达到极显著 (P＜0.01);5龄第5天幼虫经20-E处理后PLK和PNPO的转录水平无变化。5龄第1天幼虫经JHA处理后PLK和PNPO的转录水平未受到影响;5龄第3天幼虫经JHA处理后,PLK的转录水平在48 h出现显著下调且与对照的差异达到显著(P＜0.05),PNPO的转录水平在24和48 h后均出现显著下调且与对照的差异达到极显著(P＜0.05);5龄第5天幼虫经JHA处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现下调且与对照的差异达到极显著 (P＜0.01)。【结论】20-E和JHA显著影响家蚕5龄幼虫PLK和PNPO的转录水平,20-E提高5龄前期家蚕PLK和PNPO的转录水平,JHA降低5龄后期它们的转录水平,为深入研究激素对VB₆的调控奠定基础。     

重组大肠杆菌高效催化合成γ-氨基丁酸

[目的]实现重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。[方法]构建表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌Escherichia coli p ET-GAD,对催化工艺进行初步优化,实现高效催化L-谷氨酸脱羧反应合成GABA。[结果]在谷氨酸脱羧酶的表达过程中,维生素B6盐酸吡哆醇(PN)可以替代5-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶补给,提高工程菌E. coli p ET-GAD的催化活力。在50 m L反应体系中,重组细胞浓度为8 mg/m L,底物浓度为200 mmol/L,在35℃、p H 4. 4条件下反应2 h,L-谷氨酸的转化率 98%。为了提高GABA的生产效率,采用谷氨酸/谷氨酸钠分批补料方式控制反应过程中的p H值,GABA的最终浓度达到247 g/L。[结论]重组大肠杆菌可以高效催化合成γ-氨基丁酸,为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。     

饲料中维生素和无机盐对rBmNPV-Bm表达系统植酸酶基因表达活性的影响

【目的】为查明宿主的营养对重组家蚕杆状病毒-家蚕表达系统(rBmNPV-Bm)外源基因表达活性的影响,探寻提高家蚕Bombyx mori生物反应器产率的新途径。【方法】以家蚕BmNPV病毒为表达载体,以人工饲料饲养的5龄家蚕为宿主,以植酸酶基因为报告基因,探讨了家蚕人工饲料中维生素和无机盐对外源基因表达产物活性的影响。【结果】家蚕血淋巴中外源植酸酶的活性随着饲料中维生素和无机盐添加量的不同而发生显著变化。在本试验设区范围内,当维生素C的含量为饲料干物质量的1 %,B族维生素混合物为0.25 %,无机盐混合物为1 %,维生素B6为100 g饲料干物中含2 mg时,血淋巴中植酸酶活性达到最大值。【结论】通过改变家蚕饲料中微量营养成分的含量是提高rBmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的有效途径。     

家蚕云7A Sericin1基因启动子克隆及活性分析

家蚕Sericin1基因(Ser1)是中部丝腺特异表达基因,其启动子在家蚕生物反应器研究方面发挥着重要作用。为了解云南家蚕品种云7 Ser1基因上游调控序列存在的多态性,进而获得具有驱动活性的Ser1启动子序列,克隆了家蚕Ser1基因启动子并进行序列分析,构建了由该基因启动子驱动红色荧光蛋白基因Ds Red的表达载体p Bac[Ser1p-Ds RedSV40+A3-EGFP],转染家蚕Bm N细胞进行瞬时表达来验证启动子活性。该启动子同已报道Ser1基因上游调控序列比对发现,顺式作用元件区域高度保守,而其他区域存在422 bp的碱基缺失;Ser1基因上游调控序列中存在启动子TATA框和CAAT框分别位于-24~-30处和-112~-115处,其中TATA框的保守序列是TATAAAA;而启动子驱动下的Ds Red基因在Bm N细胞和中部丝腺中成功表达。结果表明云南家蚕品种Ser1上游调控序列存在多态性和驱动活性,为了解不同家蚕品种丝胶合成能力差异和获得高效启动子奠定了基础。     

腺苷钴胺素合成酶基因cobs的克隆及其在产1,3-丙二醇菌中的应用

甘油脱水酶是催化由甘油到1,3-丙二醇过程中的关键酶,它需要在辅酶B_(12)存在的情况下才能有效的进行催化;而在此催化过程中甘油脱水酶会出现失活现象,研究表明辅酶B_(12)可以有效的促使甘油脱水酶复活。因此,辅酶B_(12)在由甘油生物催化生产1,3-丙二醇过程中起到非常重要的作用。本研究利用PCR扩增技术,从Escherichia K-12菌株中扩增出产VB_(12)关键酶—腺苷钴胺素合成酶基因cobs,其序列与NCBI上已经公布的序列比对,同源性为99.6%,将基因cobs与产1,3-丙二醇关键酶基因dhaB、yqhD在Klebsiella pneumoniae中共表达,发酵结果显示重组菌所需额外添加的VB_(12)由原始菌株的0.01 g/L下降到0.004 g/L。     

重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性

将编码光合细菌Rhodobactersphaeroides 5- 氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)的同工酶基因hemA、hemT转入E .coli中进行高表达,并将高表达的同工酶进行分离、纯化.纯化的hemA是可溶的,并具有催化活性,而hemT大部分是不溶的,且在体外条件下无活性.与其它重组ALAS相比,R .sphaeroides的hemA活性表达需PLP作为催化因子,除去PLP或用硼酸钠破坏与PLP的连接,hemA活性下降90 % .hemA PLP的紫外 可见光谱分析表明hemA与PLP之间形成一个醛亚胺键,而hemT与PLP之间未形成该键.hemA对修饰组氨酸、精氨酸、胱氨酸残基的试剂很敏感,对可切割Arg15 1和Ser15 2的类胰蛋白酶也很敏感,PLP也不能阻止该酶的切割作用.抗血清试验表明,hemA、hemT的抗血清均可与小鼠的ALAS杂交,并都有一个抗原决定簇.     

增强胞内NDAH水平和乙偶姻还原酶活力提高2,3-丁二醇产量

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产菌株,首次通过弱化B.subtilis 168磷酸戊糖途径(PPP)中的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因zwf,研究了其对胞内NADH水平的影响,进而研究其对2,3-丁二醇(2,3-BD)及副产物合成的影响。弱化菌株B. subtilis168△zwf进行摇瓶发酵实验,与出发菌株相比,胞内辅酶NADH水平得到了增强, 2,3-BD产量提高了15.0%,主要副产物AC积累量下降了10.6%,但乙酸、乳酸等有机酸的积累量提高。为了进一步提高2,3-BD生产效率,在B. subtilis168中克隆表达了不同来源的ACR基因,研究发现克雷伯氏菌来源的ACR酶活力最高,将此来源的ACR的基因kphs克隆到B.subtilis168△zwf中加强表达,对重组菌株B.subtilis168△zwf/pMA5-kphs进行摇瓶发酵实验,与出发菌相比,2,3-BD产量提高了37.3 %,主要副产物AC积累量下降了28.1%,同时,乙酸等分支路径的其他副产物也有不同程度的降低。     

重组谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的工艺条件优化

谷氨酸脱羧酶,一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶,能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱羧得到γ-氨基丁酸(GABA)。构建了产Lactobacillus brevis WJH3谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-gad,以此作为菌种进行摇瓶发酵诱导培养,发酵过程中一次性添加0.05 mmol/L PLP培养24 h,破壁上清酶活达81.7 U/m L,是不添加PLP对照酶活的1.8倍。对酶转化L-谷氨酸钠生成GABA反应条件进行了优化,结果表明,在转化体系不添加PLP的情况下,底物谷氨酸钠浓度为250 g/L,反应初始p H5.0,温度37℃,加酶量60 U/g底物,转速200 r/min,在此条件下反应18 h,GABA转化率达到100%,为γ-氨基丁酸的工业化生产奠定基础。