限制性核酸内切酶与DNA相互作用研究进展

蛋白质对ＤＮＡ识别的模体中,除了锌指结构、螺旋—转角—螺旋、亮氨酸拉链和β带外,近年来发现,Ⅱ型限制性内切酶与ＤＮＡ作用的模体有许多特别之处。通过对ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ等与ＤＮＡ复合物的空间构象、一级结构分析,发现酶分子存在催化性裂缝,并且氨基端形成臂结构包绕ＤＮＡ;同时ＤＮＡ发生构象变化、螺旋扭结。这些有趣的结构有利于酶对底物的特异性结合和催化作用。     

印度木薯花叶病毒DNA在寄主植物中可能存在的形式

从印度木薯花叶病毒（ＩＣＭＶ）侵染的植物中纯化特异的核酸,经ＲＮＡａｓｅ,ＤＮＡａｓｃ,Ｎｕｃｌｅ－ａｓｅＳｌ,ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅⅢ和ＥｃｏＲＩ酶切,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｄｏｔｂｌｏｔｓ杂交证实,在感病的植株中,存在两种形式的病毒核酸：环状双链ＤＮＡ和环状单链ＤＮＡ,后者可能是病毒ＤＮＡ的（－）链,环状双链ＤＮＡ经限制性内切酶作用可得２．７ｋｂ的线性双链ＤＮＡ纯化的病毒核酸含ＤＮＡ１和ＤＮＡ２两个分子量相近的组份。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆

采用异硫氰酸胍（ＧｕＳＣＮ）和硅藻从Ｂ９５－８细胞中快速抽摸板ＤＮＡ。根据ＥＢ病毒（ＥＢＶ）Ｂ９５－８株ＤＮＡ全序列及编码ＥＢＶ胸苷激酶（ＴＫ）的开放读框ＢＸＬＦ１的结构,设计合成一对引物,并在引物的５′一端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点,用ＰＣＲ技术扩增出一含完整的ＥＢＶＴＫ基因的１．８４３ＫｂＤＮＡ片段,ＮｃｏＩ酶切分析鉴定,ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切ＰＣＲ产物和载体,使目的基因定向克隆至选     

人乳头瘤病毒16型E7基因的体外扩增及其克隆和序列分析

人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因是转化基因。作者设计了一对ＰＣＲ引物,在引物的５′端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切序列,以ＨＰＶ１６ＤＮＡ为模板成功地扩增出Ｅ７基因。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将Ｅ７基因定向克隆入ｐＵＣ１８载体,经过ＰＣＲ、酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定得到Ｅ７重组克隆ｐＨＳＥ７、ＤＮＡ序列分析表明所克隆的Ｅ７基因与已发表的ＨＰＶ１６Ｅ７基因序列完全一致且读框正确。     

原核生物DNA的程序性复制

原核生物ＤＮＡ的程序性复制薛建华明镇寰（杭州大学生命科学学院,杭州３１００１２）关键词聚合酶Ⅲ全酶复制叉程序性ＤＮＡ的复制是一个复杂的过程,需要各种蛋白质、酶之间及蛋白质与ＤＮＡ之间的相互作用,才能顺利完成。原核生物（如Ｅ．ｃｏｌｉ）是以ＤＮＡ聚合酶...     

麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

新书介绍

《ＤＮＡ 蛋白质相互作用》(ＤＮＡ ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ)ＡｎｄｒｅｗＴｒａｖｅｒｓ和ｍａｌｃｏｌｍＢｕｃｋｌｅ编著 ,2 0 0 0年ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ出版 ,375页。蛋白质与ＤＮＡ的相互作用在分子生物学领域占有重要地位。例如 ,在确定和调节染色体结构、ＤＮＡ复制、重组和修复、基因转录、病毒感染等方面具有很大作用。本书是研究蛋白质与ＤＮＡ相互之间特异作用及许多研究方法的概述。描述了目前适用的许多主要的技术方法 ,尤其是分析转录及它与染色质结构关系的生物物理方法。每一种方法…     

L—山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的Ｌ－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆｉｃｉｅｎｓＩＦ０１２２５８的染色体ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应,克隆得到了Ｌ－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致,采用ＰＣＲ方法在此基因的两端加上了Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ两个酶切位点,经Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到ｐＫＫＨｈ     

应用逆转录聚合酶链反应法扩增类胰岛素生长因子Ⅱ基因

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胚胎组织中提取总ＲＮＡ,经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离纯化出ｍＲＮＡ。用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ的ｃＤＮＡ片段,在限制性内切酶ＳｍａＩ存在的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆进ＰＵＣ１２的ＳｍａＩ位点处。经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,ＳａｌＩ,Ｅｃｏ４７Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测     

蓖麻蚕rDNA5‘—非转录间隔区的DNA序列及结构特征

我们测定了蓖麻蚕ｒＤＮＡ５‘－非转录间隔区ＳａｃⅡ－ＥｃｏＲＩ片段的ＤＮＡ序列,它的长度为１０２５ｂｐ,Ａ＋Ｔ含量大于７０％。本文报道该片段的序列特征,用计算机对其内所具的结构基序进行分析结果说明。其中含有多个与核骨架结合区有关的结构基序和酵母自主复制序列的核心序列。包括９个弯曲ＤＮＡ,１０个Ｔ盒,５个Ａ盒结构基序以及１３个拓扑异构酶的ＩＩ的识别位点的同源序列,３４个反向重复序列,３０多个ＡＴＴＡ     

板齿鼠线粒体DNA的研究

本文应用ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｃａＩ和ＸｂａＩ等１３种限制性内切酶对板齿鼠线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）进行限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ）分析,并用双酶解法构建其限制性内切酶图谱。结果表明板齿鼠存在３种ｍｔＤＮＡ单倍型,可通过限制酶ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ和ＡｐａＩ区分,呈现ＤＮＡ多态性和种内遗传变异。与小家鼠、褐家鼠ｍｔＤＮＡ限制性片段的数据相比较,板齿鼠和这两种鼠ｍｔＤＮＡ存在明显差异。板齿鼠ｍｔＤＮＡ限制性内切酶图谱的建立,为进一步系统研究鼠科动物的遗传分化提供了依据。     

用简并寡核苷酸探针筛选对虾白斑综合征病毒DNA多聚酸基因片段

根据一些病毒的ＤＮＡ多聚酶氨基酸序列中特有的保守序列ＶＹＧＤＴＤ设计的简并寡核苷酸,经地高辛标记后与对虾白斑综合征病毒基因库克隆杂交,筛选出一段长度为７０７ｂｐ的ＥｃｏＲＩ基因片段,该片段在一个开放阅读框内。并含ＤＮＡ多聚酶Ｂ家族特有的保守序列ＹＧＤＴＤＳ。经与基因库比较,其氨基酸序列与藻类ＤＮＡ病毒科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）的几株藻类病毒的ＤＮＡ多聚酶片段有部分相似,因此推测该核苷酸片     

内切酶SCaI对不同纯度质粒的酶解效率探讨

限制性内切酶ＳＣａＩ适用于多种质粒载体,尤其是融合蛋白表达载体,ｐＧＥＸ系统,因它具有二个ＳＣａＩ酶切位点,因此用ＳＣａＩ酶解图谱鉴定以ｐＧＥＸ系统为载体的重组子甚为便捷。简便碱裂解法提取重组ＤＮＡ省时,省耗。本文探讨了ＳＣａＩ对用常规和简便两种碱裂解法提取的重组ＤＮＡ的酶解效率。结果表明：（１）简便碱裂解法抽提的重组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等限制性内切酶酶解,可以获     

激光育种机理非线性研究

本文对激光与ＤＮＡ分子相互作用,考虑了随机力作用,建立了ＤＮＡ分子在激光作用下的Ｆｏｋｋｅｒ－ｐｌａｎｃｋ方程（ＦＰＥ）。分析了ＤＮＡ分子系统的ＦＰＥ势函数,对激光育种中的ＤＮＡ遗传变异的随机不确定性现象进行了解释。     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）     

绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究

实验经限制性酶切和双向Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将重组质粒ｐＣＢＨＩＩ－１４的１４ｋｂ外源片段上的绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因定位于４．４ｋｂ的ＥｃｏＲＩ片段上,将该片段克隆于质粒ｐＵＣ１９,获得重组质粒ｐＣＢＨＩＩ。通过限制性分析构建了ｐＣＢＨＩＩ上４．４ｋｂＥｃｏＲＩ片段的物理图谱。在此基础上用质粒制作该片段的亚克隆,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了含绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的４０７４ｂｐ的ＤＮＡ序列,由ＧＴ－ＡＧ规则和ｃＤＮＡ序列推知该结构基因由４个外显子和３个内含子组成,总长１６１３ｂｐ,５′端存在与一般真核基因类似的两个特征性调控序列,但３′端不存在真核基因通常具有的特征序列而存在功能未明的短重复序列和嘧啶富集区。并对纤维素酶基因间的同源性和可能的功能作了初步的探讨。     

生物素肼化学标记和DIG标记cDNA探针检测柑桔裂皮病类病毒

分别用生物素肼化学标记和ＤＩＧ标记我国柑桔裂皮病类病毒（ＣＥＶｄ）全长克隆ｃＤＮＡ,用以上探讨对不同来源的的核酸样品进行斑点杂交。两种探针可检出病柑桔总核酸的最低含量久为４００ｎｇ／斑点和８０ｎｇ／斑点;生物素肼标记ＣＥＶｄ－ＤＮＡ探讨针,可检出ＣＥＶｄ－ｃＤＮＡ的最低含量约为１０ｐｇ／斑点,研制的ＣＥＶｄ检测试剂盒能检测出发病和隐性带毒苗木中的ＣＥＶｄ,灵敏、特异、简便、快速。试剂盒已使用于检测     

蛋白质－DNA相互作用与真核基因转录

结合最近几年对真核转录调节因子和ＤＮＡ的结构与机能研究,概述了蛋白质－蛋白质及蛋白质－ＤＮＡ相互作用方式以及介导相互作用的分子结构基础,论述了转录因子之间,转录因子与ＤＮＡ之间相互作用过程中的同与拮抗作用,发生机制及其在真核基因转录调节中的遍性和重要意义。     

通过微切—扩增建立植物（蚕豆Vicia faba）染色体区段特异性基…

以蚕豆根尖为材料,采用改良方法制备染色体标本,在光镜下切割分离一段大Ｍ染色体核仁组织区（ＮＯＲ）特定区段,通过单一引物－－聚合酶链式反应法随机扩同切ＤＮＡ后,获得近６０μｇＤＮＡ。经琼脂糖电泳分析测定扩增产物分子片段大小介于２００－９００ｂｐ。以地主新标记蚕豆总体ＤＮＡ。作为探针与扩增产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实扩增得到的ＤＮＡ与蚕豆ＤＮＡ同源,来自微切染色体。部分扩增产物经ＥｃｏＲＩ酶切后