胰岛素对大鼠肝内皮细胞脂酶活性的影响

肝性甘油三酯脂酶分布在肝窦内皮细胞表面,故又称肝内皮细胞脂酶(HEL)。已证实肝素可使大鼠的HEL释放。Nikkila和Kuusi等研究指出HEL对高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)的清除起重要作用,是HDL分解代谢的关键酶。为了深入了解胰岛素对脂质代谢的影响,我们研究了胰岛素对正常大鼠HEL活性的影响。实验动物为200～250g正常雄性大鼠。     

GM_3在几种哺乳动物肝脏和狗红细胞中的含量及其分离纯化

从正常兔、猪和狗的肝脏及狗红细胞中分离纯化了总神经节苷脂,测定了脂结合唾液酸,进行了高效薄层层析,比较了上述四种组织中GM_3的含量。结果表明狗红细胞中的GM_3的含量较另三种的高,狗肝和兔肝次之,猪肝含量甚微。从狗红细胞中提取和纯化了GM_3,其得量为每毫升压积红细胞351.0μg,纯度为92.2％。     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

GM3在几种哺乳动物肝脏和狗红细胞中的含量及其分离纯化

从正常兔、猪和狗的肝脏及狗红细胞中分离纯化了总神经节苷脂,测定了脂结合唾液酸,进行了高效薄层层析,比较了上述四种组织中GM₃的含量。结果表明狗红细胞中的GM₃的含量较另三种的高,狗肝和兔肝次之,猪肝含量甚微。从狗红细胞中提取和纯化了GM₃,其得量为每毫升压积红细胞351.0μg,纯度为92.2％。     

持续性全身炎症抑制动脉粥样硬化大鼠LPL活性的研究

目的:观察持续性炎症对动脉粥样硬化大鼠肝素后脂蛋白脂酶活性及相关代谢物的影响.方法:试验动物分为4组:对照组、单纯高脂饮食组、炎症组和抗炎组.单纯高脂饮食组给予高脂饮食;炎症组除高脂饮食外,用酵母多糖腹腔注射(20 mg/kg,1次/3天)进行炎症刺激;抗炎组动物除按炎症组处理外,用阿司匹林进行抗炎治疗;对照组为正常饮食.动物饲养8周.第4、8周时测血清肝素后脂蛋白脂酶的活性,并用ELISA法检测TNF-α和CRP水平以及酶法测定TG、LDL和HDL含量.结果:与单纯高脂动脉粥样硬化大鼠相比,叠加的炎症刺激能明显升高血清中TNF-α和CRP水平,并显著降低肝素后脂蛋白脂酶活性,TNF-α和CRP水平的变化与肝素后脂蛋白脂酶活性的变化均呈显著负相关;同时,血清TG、LDL含量显著升高,而HDL含量显著降低;阿司匹林(12mg/kg,1次/日)能明显降低大鼠血清中TNF-α和CRP的水平,升高肝素后脂蛋白脂酶活性,降低TG和LDL的含量,并升高HDL含量.结论:持续性全身炎症刺激可以明显降低动脉粥样硬化大鼠模型血清肝素后脂蛋白脂酶活性,从而加重TG、LDL和HDL的代谢紊乱.     

肝脂酶基因多态性与冠心病的关系

肝脂酶 (hepaticlipase,HL)对血浆脂蛋白的代谢起重要作用 ,它影响着血浆中高密度脂蛋白 (HDL)的水平以及低密度脂蛋白 (LDL)的种类 ,因此肝脂酶的活性与冠心病的发生具有相关性。肝脂酶基因的单核苷酸多态性 (SNP)与酶的活性相关 ,并影响血浆脂蛋白水平以及冠心病的发生。为研究肝脂酶基因的单核苷酸多态性与中国汉族冠心病的相关性 ,采用聚合酶链反应、变性高效液相色谱及DNA测序等技术对 10 2例经冠状动脉造影确诊的冠心病患者和 84例正常对照的肝脂酶基因 (包括启动子区以及所有外显子 )的SNP进行了研究 ,结果在肝脂酶基因启动子区发现了一未见文献报道的多态位点 ,即- 2T→C转换。经检验 ,对照组和病例组基因型频率的分布符合Hardy Weinberg平衡。冠心病患者组中 - 2C等位基因的携带者 (基因型为TC或CC)显著高于对照组 (5 7.9%versus 4 2 .7% ,χ2 =4 .181,df=2 ,P =0 .0 4 1) ,且冠心病组中 - 2C等位基因的频率显著高于对照组 (χ2 =3.988,df =1,P =0 .0 4 6 ,OR =1.5 8,95 %CI =1.0 1～ 2 .4 7) ;在冠心病组中进一步发现 -2C等位基因与高密度脂蛋白胆固醇水平升高相关 (P <0 .0 5 )。这提示肝脂酶基因的 - 2T→C多态性可能与血浆高密度脂蛋白胆固醇的水平以及冠心病的发生具有相关性。     

狗肝铜锌超氧化物歧化酶的纯化

本文采用加热、硫酸铵分级沉淀和柱层析的方法,从狗肝中提纯了铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD),并对其理化性质进行了鉴定。结果表明酶的纯度均一。与文献报道的不同来源的同类酶相同,狗肝Cu·Zn-SOD系由两个相同亚基组成的二聚体,每分子晦蛋白合有两个铜和两个锌原子。分子量33.6kD,N-末端氨基酸为丙氨酸。     

食神鞘氨醇杆菌(Sphingo spiritivorum)肝素酶的制备和性质研究

筛选新型肝素酶产生菌,制备新型肝素酶并对其降解肝素能力进行测试。采用定向富集方法对土壤中的菌群进行培养,筛选分离产肝素酶的新种菌株,利用微生物发酵和蛋白纯化技术制备肝素酶,考察新型肝素酶的理化性质和酶切位点,之后使用新型肝素酶降解肝素并测试产物特征。筛选分离得到1株新的肝素酶产生菌,属食神鞘氨醇杆菌(Sphingo spiritivorum)。发酵后得到的粗酶,经多步柱层析纯化后得到的新型肝素酶SShep I和SShep II,用得到的酶降解肝素得到两种新型酶制低分子肝素。利用食神鞘氨醇杆菌中分离纯化得到的两种新型肝素酶SShep I和SShep II制备的新型酶制低分子肝素,有望开发成抗凝血效果更佳或具有新临床功能的低分子肝素药物。     

γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响 一、酶活力的比较研究

用大鼠、小鼠及狗作为实验动物进行辐射对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力影响的比较研究。在离体实验中,用9700或97000拉德照射大鼠及小鼠的肝素抗凝血,可观察到红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力轻微减低,而在整体实验中却得到以下的不同结果: 1.用400、600及700拉德分别照射大鼠,均可使酶活力下降。400或600拉德照射后酶活力下降至一定时日可恢复至照射前水平,但700拉德照射后酶活力一直下降且始终未恢复。照射后大鼠酶活力的抑制与恢复程度与辐射损伤的轻重有关。2.以800、900和1000拉德的剂量分别照射小鼠后,酶活力无明显变化。经700或1200拉德照射后第1天,狗的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力较照射前显著下降,而且以后各日,一直处于低的水平。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

应用于工业生产的高效脂酶

利用原核生物生产脂酶具有很大的商业潜力。一个由CEC BRIDGE资助的项目正致力于研究假单胞菌脂酶。假单胞菌属(Pseudomonas)脂酶是一类独特的脂酶,在从食品到清洁剂等广泛领域内具有极好的应用特性。通过获得脂酶的结构信息,研究其活动机理,产生专门应用于特殊工业生产的特制脂酶是可行的。对P.glumae脂酶和另外一些脂酶的活性进行了筛选。将从不同脂酶获得的结果与其单独的结构信息比较,为这些脂酶的位置专一性提供详细的资料。当上述工作全部完成后将进行脂酶的动力学研     

抗人肝素酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:肝素酶在白细胞游走和恶性肿瘤转移的过程中发挥重要作用,肝素酶抗体的制备对于自身免疫病和肿瘤的良恶性鉴别诊断具有重要意义。制备抗人肝素酶单克隆抗体,用于肝素酶的研究及临床恶性肿瘤的鉴别诊断。方法:通过杂交瘤技术将分泌抗人肝素酶单抗的小鼠B细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,获得稳定分泌抗人肝素酶单抗的杂交瘤细胞;用有限稀释法获得单克隆,以重组人肝素酶及含肝素酶的血小板裂解液对抗体进行Western印迹检测。结果:Western印迹结果显示制备的单抗与人肝素酶具有特异性免疫识别特性。结论:获得了能够特异性免疫识别人肝素酶的分泌性抗人肝素酶单克隆抗体。     

肝素酶在医药领域应用的研究进展

肝素酶是一类能够特定切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键并将其裂解成有活性寡糖片段的酶,主要分为真核生物肝素酶(Heparanase)和原核生物肝素酶(Heparinase)。由于原核生物肝素酶是一种高效绿色的生物催化剂,因此近年来在医药领域的应用性研究逐渐被重视。文中结合本课题组相关工作,归纳介绍了原核生物肝素酶通过作用于硫酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)生成肝素小分子,抑制肿瘤细胞增殖方面的应用;原核生物肝素酶在制备第三代创新型抗凝血药物低分子量肝素(Low molecular weight heparin,LWMH)和超低分子量肝素(Ultra low molecular weight heparin, ULMWH)方面的应用;原核生物肝素酶作为肝素拮抗药物等医药领域的重要应用;并展望了原核生物肝素酶的未来应用前景及挑战。     

肝素酶研究进展

微生物肝素酶是一类作用于肝素和类肝素的多糖裂解酶,在低分子肝素的制备以及肝素类分子的结构解析等领域具有十分重要的应用前景。本文将结合微生物基因组测序的最新进展,综述微生物肝素酶的来源,并对肝素酶的作用机理加以讨论;结合本实验室研究对肝素酶的重组表达及其在低分子肝素生产的应用最新进展作以综述,并对肝素酶其它潜在的应用作以讨论。     

酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用

目的：建立一种简便、微创的血清肝素酶酶联免疫吸附（ELISA）定量检测方法,并对肿瘤患者和正常人血清肝素酶进行比较,初步探讨血清肝素酶水平与肿瘤发生、发展的关系。方法：选择鼠抗人肝素酶单克隆抗体和兔抗人肝素酶多克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法,并利用此方法检测健康献血者和肿瘤患者血清中的肝素酶水平。结果：组内数据稳定,可重复;肿瘤患者血清中肝素酶D450nm值高于健康献血者。结论：所建立的血清肝素酶ELISA检测方法灵敏、高效,可用于肿瘤的辅助诊断。     

Ca~(2+)通过膜脂影响肌质网Ca~(2+)-ATP酶的活性与Ca~(2+)转运功能

重建在大豆磷脂脂质体上的兔骨骼肌肌质网Ca~(2+)—ATP酶在ATP驱动下可将溶液中的Ca~(2+)转运到脂酶体内部;外加EGTA则可除去脂酶体外部的Ca~(2+),由此可得到四种含Ca~(2+)状态不同的脂酶体:(1)内、外都无Ca~(2+);(2)仅外部有Ca~(2+);(3)内、外都有Ca~(2+);(4),仅内部有Ca~(2+).用DPH和AS系列萤光探针对这四种含Ca~+状态不同的脂酶体的膜脂流动性进行了测定,结果表明:脂酶体外部加入Ca~(2+),脂双层外表面的流动性降低.当Ca~(2+)进入脂酶体内部后,内表面膜脂的流动性也降低,而且外层膜脂流动性进一步降低.脂酶体内、外的Ca~(2+)含量不同时,Ca~(2+)—ATP酶功能状态也不同.转运到脂酶体内部的ca~(2+)积累到一定浓度后,通过Ca~(2+)泵向内转运的Ca~(2+)及Ca~(2+)—ATP酶活力都受到了抑制.转运进行到第四分钟时的酶活只有第一分钟的9%.但在相同的实验条件下,失去了完整的膜结构的纯化的Ca~(2+)—ATP酶蛋白没有被抑制.这提示完整的膜结构是这种抑制作用所必需的,而且膜两侧Ca~(2+)浓度的梯差可通过影响膜脂来调节Ca~(2+)—ATP酶的功能.     

乳腺癌乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达及其与肿瘤血管生成的关系

目的探讨乳腺癌中乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达与乳腺癌血管生成的关系和意义。方法应用免疫组化SP法检测95例乳腺癌组织和20例癌旁正常组织中乙酰肝素酶、bFGF、VEGF和CD34的表达,并联合运用RNAi技术沉默乳腺癌细胞系MDA-MB-231乙酰肝素酶的表达,观察bFGF、VEGF的变化情况,分析乙酰肝素酶、bFGF、VEGF表达的意义以及其与乳腺癌血管形成、预后之间的关系。结果免疫组织化学染色证实乙酰肝素酶（64／95）、bFGF（72／95）和VEGF（65／95）主要表达在癌细胞质和（或）细胞膜中,在癌旁正常组织中则呈阴性表达。统计分析结果显示：乙酰肝素酶和bFGF、VEGF的表达具有明显的一致性,乙酰肝素酶阳性表达病例中bFGF、VEGF表达率明显比乙酰肝素酶阴性表达病例高,向人乳腺癌细胞系中转染乙酰肝素酶特异性siRNA,抑制乙酰肝素酶的表达后发现VEGF、bFGF的mRNA表达水平下调。乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达与乳腺癌患者的肿瘤直径、临床分期、组织学分级、淋巴结转移及5年生存率密切相关,乙酰肝素酶和（bFGF／VEGF）共表达时与微血管密度的相关性比乙酰肝素酶单独表达更显著。结论乙酰肝素酶阳性表达与乳腺癌侵袭转移密切相关,乙酰肝素酶在乳腺癌中过度表达可能通过释放bFGF、VEGF促进肿瘤血管生成。     

硫酸乙酰肝素、肝素酶及其与肿瘤转移的关系

细胞外基质和基底膜的降解是癌细胞穿透组织屏障发生转移的重要步骤。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是细胞外基质和基底膜的组成成分,其多糖侧链可以被葡萄糖苷内切酶--肝素酶,特异性识别并切割,以破坏细胞外基质和基底膜的完整性,促进肿瘤转移。临床上肿瘤患者肝素酶高表达与肿瘤恶性程度和转移发生密切相关。深入了解硫酸乙酰肝素、肝素酶及它们与肿瘤转移相关的作用机制有助于我们寻找肿瘤治疗的新思路。本文将从硫酸乙酰肝素的合成调控、功能、肝素酶的转录和活性调节、肝素酶表达与肿瘤患者的临床特征,以及硫酸乙酰肝素、肝素酶与肿瘤转移的关系进行综述。     

微生物脂酶及其在环境生物技术领域中的应用

脂酶是生物体内脂类物质 (三酰甘油脂 )生物转化过程中不可缺少的催化剂。除其生物学意义外 ,脂酶在食品加工、生物医学、化工及环境保护等众多领域中有着巨大的应用前景。脂酶具有在液相和非液相 (即有机相 )界面间起催化作用的独特性能 ,使其与酯酶不同。脂酶界面激活的概念源自以下事实 ,即脂酶的催化活性通常依赖于底物的聚集状态。可以认为脂酶的激活涉及到酶的活性部位的暴露和结构变化 ,这种变化需要在有水包油液滴存在下通过构象的改变来实现。脂酶的活性与反应体系的表面积有关。最近对几种脂酶结构的研究结果为深入理解其水解活性…     

固定化酶解猪小肠黏膜制备肝素的工艺研究

本文以肝素效价为指标,探索了固定化胰蛋白酶对小肠黏膜的酶解作用。在单因素试验基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计和响应面(RSM)分析法,以肝素效价为响应值,通过考察p H值、加酶量、酶解温度及料液比,优化了固定化胰蛋白酶酶解制备肝素的工艺,建立了二次回归方程。结果表明,p H值、酶解温度、加酶量、及料液比均对肝素提取具有显著影响。固定化酶制备肝素最佳工艺条件为:p H为11,加酶质量分数为0.24%,酶解温度为46℃,料液比为1∶3.3(g/m L),酶解时间为5 h,在此条件下获得肝素酶解液效价为15.28 U。