一种新的广谱寄主的DNA克隆技术—PRK290与PRK2013双载体系统介绍

近年来,一种用于DNA克隆的双载体系统发展十分迅速。这种系统有许多优点,特别是它广谱寄主的特性,是我们过去常用的一些载体系统所不具有的。在实际应用中,它已显示出作为一种有效的多用途的DNA克隆载体的潜力。这就是以PRK290质粒为克隆载体、以PRK2013质粒为帮助质粒(helper Plasmid)可转移进各种革兰氏阴性菌的双载系统。     

农杆菌Ti质粒的改造及其衍生的质粒载体

Ti质粒是农杆菌介导基因转化的重要部件,它是农杆菌染色体外的遗传物质。野生型Ti 质粒虽然是植物基因工程的一种天然载体,但把它用作常规的克隆载体却存在4点缺陷,为了使Ti质粒适于基因工程的需要,必须对其进行改造。改造Ti质粒方法目前有:共整合载体和双元载体。     

人类基因组分析中新的分子工具-YAC

通常用于ＤＮＡ克隆的载体,如质粒、λ噬菌体载体ｃｏｓ质粒（ｃｏｓｍｉｄ）等,其容量５０ｋｂ,对于多数基因或某些小的基因簇,这个容量是足够的。但对于人类基因组研究和某些大基因的克隆,这些载体就有相当的局限性。例如人类第Ⅷ因子基因编码凝血因子,它的缺陷可...     

基因工程

卿1135利用甲醉的Aeetobaeter啡山a.uC.MB 58的启动子探针载体的构建咦1/sehroeder,R·…11 Actaaiotcchnol一1 989,9(3)一219一225降自DBA,1989,8(]9),89一11145〕 载体质粒pRsZ由于广寄主范围复制子质粒RSF 1010的存在,因而可用在上述醋杆菌或大肠杆菌,它提供启动子克隆的单一限制性位点及选择转化体的抗性标记.该载体是把质粒pUC19的EcoRI一sall多聚接头插人到用&oRI/sa江消化的质粒pMK一6中构建得到的.产生的抗卡那霉素质粒pRsl被克隆到质粒RSF!010的EcoRI位点上,并用来转化大瓜扦菌C 600.含杂交质粒克隆的选择在含Km和S…     

用单链噬菌体载体克隆DNA

丝状单链DNA大肠杆菌型噬菌体M 13、fd及f1,近来被作为一类新的DNA克隆载体而发展起来了,它的优点显著超过其它载体,包括其它两类大肠杆菌寄主的克隆载体:质粒和噬菌体λ。本综述描述单链噬菌体载体的生物学及应用方法以及测量插入DNA大小和排列方向的快速方法,特别是单链载体对DNA定序和离体位点定向诱变     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成,且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的 …

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自     

枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

大片段克隆载体研究进展

DNA克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段。自第一个质粒载体pSC1 0 1作为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了YAC和BAC克隆体系。随着植物基因组计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段DNA又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能互补实验的载体。综述了几种常用大片段克隆载体YAC、BAC、BIBAC、PAC和TAC的特点及其应用 ,并对克隆载体的发展作了展望。     

枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

基因工程

862962装配型质粒克隆用载体〔专,英]Hunter,1.5.了European Patent Appl.EP 0146368.Pub.26.06.85.Appl.GB833659,filed 16.12.83〔译自CBA,1985, (9),2835」 构建了一个双功能的杂种装配型质粒克隆载体,它能够在大肠杆菌和链霉菌属中复制。这个载体叫pPZ74,它可能用于在大肠杆菌中构建基因文库,然后,可以下经进一步的DNA操作,即能被转回到链霉菌中。 (郭殿瑞)862963编码兔肿瘤坏死因子(TNF)的DNA,具有上述插人的DNA的运载体,用上述载体转化的寄生,兔TNF多肤和这种肚的生产方法〔专,日〕/Yamada,M一了European Patant Appl。…     

葡萄白藜芦醇合成酶基因的克隆

为了构建白藜芦醇合成酶(RS)基因的克隆载体,用PCR技术从葡萄叶片总DNA中扩增出RS基因全长,然后将其重组到克隆载体中。通过酶切对重组质粒进行了鉴定和测序,结果表明,RS基因已经正确克隆至pUC19中,将重组质粒转入大肠杆菌里,使RS基因能够在大肠杆菌里保存并且大量扩增,为RS基因构建表达载体表达白藜芦醇合成酶奠定了基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

基因操作原理(续)——第八章 在哺乳动物细胞中克隆

前面几章表明,有很多质粒和噬菌体可作为载体在原核细胞(特别是大肠杆菌)中克隆。然而,明显对比的是,现今只有唯一的一类载体被用于哺乳动物细胞克隆。这类载体是从猿猴病毒40(SV40)衍生而来的。SV40是致瘤的乳多泡病毒(papovavirus);     

人类泡沫逆转录病毒

根据 pHSRV1 3全基因组图谱和 pBR3 2 2质粒载体上限制酶切位点的性质 ,利用分子克隆技术 ,使 pHSRV1 3质粒上的bel1基因缺失突变并重新构建质粒载体 pHSRV1 3 -BR3 2 2 ,最后克隆到 1株含有目的基因组片段的重组质粒。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的:构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法:将带有牛肠激酶催化亚基(bEKL)的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果:琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论:表达质粒构建成功。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的：构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法：将带有牛肠激酶催化亚基（bEKL）的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果：琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论：表达质粒构建成功。     

牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效