丙型肝炎病毒C区基因的克隆与分析

通过RT－PCR从1份来自甘肃武威地区献血员HCV阳性血清顺克隆到573bp的HCV核心基因全片段,用T－A克隆载体法将该片段接入克隆载体pUC19中并测序,结果表明武威地区分离株与Ⅰ型株HCV－Ⅰ和Ⅱ型株HCV－HeBei在该基因区段的核苷酸／氨基酸序列同源性分别为89.6%／95.4%、97.3%／97.4%,属于Ⅱ型株。     

丙型肝炎病毒C33_c单克隆抗体的研制和鉴定

用丙型肝炎病毒重组蛋白Ｃ３３_ｃ抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,运用杂交瘤技术成功地建立了７株能稳定分泌抗Ｃ３３_ｃ单克隆抗体的杂交瘤细胞１Ｈ６Ｄ２、２Ｇ１Ａ６、３Ａ４Ａ８、３Ｅ３Ｅ７、４Ｇ１２Ｃ１０、４Ａ１０Ｃ２、５Ｆ４Ｂ６．试验结果表明,７株ＭｃＡｂｓ具有良好的ＨＣＶ特异性,间接ＥＬＩＳＡ法测得小鼠腹水ＭｃＡｂ效价为１：１０￣４－１：４×１０￣４;竞争抑制实验和相加指数测定证实７株ＭｃＡｂｓ识别相关的抗原表位;７株ＭｃＡｂｓ中１株为ＩｇＭ（５Ｆ４Ｂ６）,其它６株为ＩｇＧ（２ａ）。     

一种新的人端粒相关锌指蛋白cDNA的克隆及鉴定

为了从早期胚胎寻找与发育分化有关的新基因,本文构建了3周龄人胚cDNA文库,并应用EST技术对该文库中随机挑选的47个低丰度克隆进行测序,结果发现了一个与人亚端粒DNA和锌指基因同源的cDNA克隆(L30),该基因长约3.8kb,5＇端序列有明显的阅读框架(ORF),3＇端序列有加尾信号(AAUAGA)和有39个A组成的Poly(A)尾巴;通过Northern杂交确认在早期人胚胎中有表达,应用地高辛染色体原位杂交技术将其定位于人第12号染色体长臂端部.     

肝癌病人血清中丙型肝炎病毒E2／NS1基因区cDNA的克隆及序列分析

从一个抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）阳性的肝细胞癌（ＨＣＣ）病人血清中提取ＲＮＡ,随机引物逆转录为ｃＤＮＡ后,用ＨＣＶ特异引物进行聚合酶链反应。将扩增产的７８０ｂｐ插入ｐＵＣ１８和ｐＵＣ１９质粒载体,双脱氧链末端终止法测定其序列。与慢性丙型肝炎病人或携带者血清中的ＨＣＶ序列比较,核苷酸同源性介乎６９．２３％－８９．１０％,氨基酸同源性介乎７４．５９％－９０．５７％,分析表明,此序列属于１组Ⅱ型。本文结果     

原位杂交检测石蜡包埋组织中丙型肝炎病毒RNA

为了提高ＨＣＶＲＮＡ的原位杂交检出率,我们应用地高辛标记ＨＣＶ５＇非编码区ｃＤＮＡ作探针,采用原位分子杂交法对９６Ｎ肝硬变,１０２例肝细胞肝癌进行了ＨＣＶＲＮＡ检测,并结合不同年份标本中ＨＣＶＲＮＡ的检出率,探讨ＨＣＶＲＮＡ在肝脏的分布及其丢失问题．结果显示ＨＣＶＲＮＡ定位于肝细胞和肝癌细胞胞浆内,肝脏其它细胞未见明确阳性杂交信号。ＨＣＶＲＮＡ杂交阳性细胞呈灶状和弥漫分布,正常对照、替代、空白对照为阴性,在不同年份肝硬变及肝细胞肝癌中两两比较表明新近包埋蜡块组织较陈旧蜡块组织ＨＣＶ　ＲＮＡ检出率明显高。本文结果证实ＨＣＶＲＮＡ存在于肝细胞和癌细胞的胞浆内,未见肝内其它细胞阳性,还发现ＨＣＶＲＮＡ在肝硬变、肝细胞癌中的检出率随保存时间的延长,其阳性检出率明显降低,表明ＨＣＶＲＮＡ在蜡块中存在明显的降解,应尽可能选用近期标本、为临床分析ＨＣＶ感染,ＨＣＶ与肝硬变、肝细胞肝癌的关系提供更客观的数据。     

丙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染严重危害人类健康,目前尚无特效的治疗方法。ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗是近年来的研究热点之一,它的研制为预防和治疗ＨＣＶ感染提供了新的思路。本文从ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗的构建、免疫效果的影响因素、作用机制等方面作一综述。     

丙型肝炎病毒PNA打点杂交检测方法同RT—PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５＇端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ折方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异的检出血清中ＨＣＶ ＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法     

我国西部1a型丙肝病毒结构区的cDNA克隆和序列分析

克隆我国西部丙型肝炎病毒全部结构区基因,为探讨HCV的变异和致癌作用,研制丙肝疫苗作准各。从1名西安市丙肝感染血液中,用Trizol试剂裂解HCV病毒颗粒,用糖原与RNA共沉淀提取HCVRNA,用AMV逆转录酶和随机引物逆转录为eDNA,用RT-PCR方法扩增目的片段并转化到pGEM-T质粒,得到pGEM-T-HCVc、pGEM-T-HCVel和pGEM-T-HCVe2克隆。将以上3个克隆用特定的酶降解,用连结酶进行连接,构建了HCV结构区的完整克隆。将克隆好的质粒pGEM-T-HCVjg从两端双向测广手,得到完整的HCV结构基因eDNA核苷酸序列,总长度为2238bp,与已发表的HCV序列长度一致,未发现缺失或移码突变,序列中间亦未发现转录终止子。本序列与HCVla、lb序列核苷酸的同源性分别为91．8％、84．5％;氨基酸的同源性分别为94.2％、86．3％;应为HCVla亚型。以上结果说明我国西部地区存在HCVla亚型,所克隆HCV结构区eDNA克隆可以用于基因工程表达。     

丙型肝炎病毒RNA和丙型肝炎病毒抗体在慢性丙型肝炎干扰素治…

干扰素是慢性丙型肝炎抗病毒治疗的首选药物。近年来,丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ和抗－ＨＣＶ检测方法的建立为干扰素疗效监测提供了新的手段。本文就这方面的进展作简要综述。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的研究进展

丙型肝炎病毒感染常呈慢性化,且易使病情进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。其基因的多变性使得疫苗研究进展缓慢,鉴于NS3蛋白酶在病毒体的成熟和复制中所起的重要作用,阐明结构和功能,寻找其抑制剂可能对抗病毒治疗有重要意义。     

肝癌细胞系（HepG2）感染HCV RNA的研究

为建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染和细胞培养系统,用定量的HCV RNA阳性血清感染人肝癌细胞系（HepG2细胞系）,应用地高辛标记HCV RNA探针原位杂交技术和RT－PCR方法对感染后的细胞和上清液听 HCV RNA进行了检测。在感染后的第一代至第七代的细胞中出现特异性杂交阳性信号,第一代、第二代和第六代检测出HCV RNA正链,并在感染后第一、二代检测出HCV RNA负链。显示HCV不仅能在体外感染HepG2细胞系,而且在基因的复制,证明HepG2细胞能作为HCV的体外细胞培育系。     

介绍一种鉴定胚胎干细胞基因打靶快速、经济的筛选新方法

小鼠基因剔除动物模型越来越广泛地应用于哺乳动物基因功能与疾病的研究。然而每当胚胎于细胞同源重组的效率过低时,鉴定与分离带有定位变异的阳性克隆就会既费力又昂贵。本工作以类固醇受体共激活子基因为例,研究出一种快速鉴定阳性克隆的新方法。在构造重组载体时,将一段编码半乳糖苷酶的DNA序列整合到共激活子基因的蛋白起始码后面。于是,在干细胞内同源重组发生以后,半乳糖苷酶的表达就会受控于内源性共激活子基因的启动子。在载体与半乳糖苷酶DNA随机整合的大多数非特异克隆中,因为缺少启动子或由于不正确的氨基酸编码连接,导致合成牛乳糖苷酶的可能性较小。因此,在半乳糖苷酶染色阳性的克隆中,具有特异突变的阳性克隆可以富集30倍以上。从牛乳糖苷酶的阳性克隆中,再用Southern Blot方法进一步确认带有基因剔除的阳性克隆就大大减少了工作量。因为半乳糖苷酶的细胞化学染色法简便而可靠,所以在重组效率低时,可以用这种方法在短期内筛选大量克隆。但是应该注意,应用该方法的前提条件是所研究的基因必须在胚胎干细胞内表达。这种方法更为重要的意义在于当带有基因剔除的胚胎干细胞发育成小鼠后,牛乳糖苷酶的组化染色法可以轻而易举地用来揭示所研究基因在动物不同组织与细胞中的表达水平。     

SIMPLE AND RAPID METHOD FOR SCREENING ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF BIFIDOBACTERIUM SPECIES OF HUMAN ISOLATES

The objective of this research was to develop a rapid procedure for the screening antimicrobial activities of Bifidobacterium species of human isolates. A bifidobacteria selective medium BIM-25 agar was modified by adding of 0.5 g/L cysteine-hydrochloride, 1.5 g/L lithium chloride, 1.0 g/L beef extract, and 5 mL/L Tween 20. This medium was inoculated (45C) with diluted fecal material from 5 subjects and overlaid into 0.1% Tween 20 BHI agar plates. Plates were incubated in anaerobic chamber at 37C for 48 h. Plates were then inverted to allow the two layers of agar to fall into the petri lid. BHI soft agar (0.45%) containing Micrococcus luteus (as indicator) was overlaid onto the other layers in the petri dish. Plates were incubated at 37C overnight and zone of growth inhibition was observed. This method is simple and rapid whereas the original method for screening of antimicrobial activities of bifidobacteria is a more time consuming and cumbersome procedure.     

我国非肠道传播非甲非乙型肝炎(丙型)病毒NS3蛋白的部份cDNA克隆及序列分析

用15ml非肠道传播非甲非乙型肝炎病人的混合血清提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应(PCR)扩增,获得583个核苷酸的非肠道传播非甲非乙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的cDNA片段.该片段与美国报道的同片段HCV cDNA原型比较,核酸序列同源性为80.9％,氨基酸序列同源性为93.2％。与日本报道的同片段J1 HCV cDNA相比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为92.6％和95.2％。用α-~(32)P同位素标记该片段,与HCV病人血清出现杂交反应。     

常规组织切片凋亡细胞原位末端标记方法

凋亡是有别于组织坏死的一种细胞死亡方式,多与基因调控的编程性死亡有关。准确地判断细胞凋亡对探讨程序化细胞死亡诱发机制具有重要意义。本文采用Biotin-16-dUTP对凋亡细胞内DNA断裂片段的末端进行标记,可原位检测常规组织切片上的凋亡细胞,方法具有敏感、直观、重复性好等优点。     

应用原位逆转录PCR技术检测石蜡切片中HCVRNA

利用原位逆转录聚合酶链式反应（ＩＳＲｔＰＣＲ）技术检测了１５例肝细胞癌及其癌旁肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的定位及分布,并探讨影响实验结果的重要因素。结果表明ＨＣＶＲＮＡ阳性信号主要位于肝细胞和癌细胞胞浆,胞核几乎阴性。影响结果的主要因素包括所用蛋白酶Ｋ浓度,消化切片的时间,组织固定所用固定剂的选择及ＰＣＲ扩增的循环次数等