猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

桃脂氧合酶基因的原核表达分析

利用RT-PCR技术从桃(Prunus persica L.)基因组中克隆到脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因3(PpLOX-3)的ORF全长.ORF全长与原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建重组原核表达载体pET-LOX-3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,通过SDS-PAGE电泳,得到一条约125 kD的融合蛋白条带,除去pET-32a(+)自身诱导的约20 kD大小的蛋白后,结果与PpLOX-3编码的约105 kD蛋白的大小一致.     

荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽及表达研究

目的:构建荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽(BSP)并研究其在pET-21a(+)中的蛋白表达.方法:设计荷包猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增荷包猪SLA-2-HB-BSP复合基因,并克隆至pMD(R)19-T Simple Vector,经酶切鉴定后,将SLA-2-HB-BSP复合基因与表达系统pET-21a(+)连接,并转化BL21 (Rosetta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白.结果:PCR结果显示,SLA-2-BSP大小为900bp左右,并成功克隆至pMD(R)19-T Simple Vector载体,酶切后大小为876bp,该基因连接pET-21 a(+)并转化宿主菌BL21(Rosetta)后,经诱导表达和SDS-PAGE检测,目标蛋白大小为34.4kDa,经优化后目的蛋白相对表达含量达到了45％.结论:该研究成功构建荷包猪SLA-2偶合BSP的pET-21a重组表达系,为下一步构建猪SLA Ⅰ类分子四聚体奠定了基础.     

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。     

艰难梭菌毒素A的可溶性表达及抗原性分析

目的 实现艰难梭菌(Clostridioides difficile,C.difficile)毒素A(toxin A, TcdA)的可溶性表达并鉴定其抗原特异性。方法 使用生物信息学软件对TcdA受体结合域进行B细胞表位分析,选择优势抗原表位区段进行基因合成。将合成的基因连接到表达载体pET-28a和pET-32a中,构建重组质粒pET-28a/TcdA和pET-32a/TcdA,转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,并对诱导温度进行优化。采用镍柱纯化融合蛋白,然后用肠激酶酶切获得目的蛋白。最后使用艰难梭菌检测试剂盒检测蛋白的抗原性。结果 选择TcdA受体结合区域优势抗原表位区段2 231～2 708 aa进行表达。成功表达pET-28a/TcdA和pET-32a/Trx-TcdA重组蛋白。其中pET-28a/TcdA为包涵体形式。pET-32a/Trx-TcdA实现了部分可溶性表达,并且优化诱导温度(18℃)后,可溶性表达量进一步提高。表达的pET-32a/Trx-TcdA融合蛋白纯度较好,产量约为4.5 mg/L,经酶切后获得几乎没有冗余氨基酸的TcdA。经检测,TcdA蛋...     

以结核杆菌hsp70为载体的“通用型”禽流感疫苗构建及免疫效力研究

化学合成H5N1亚型禽流感病毒M2蛋白N端胞外域基因序列3拷贝基因(3M2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建表达载体pET-3M2e 与pET-3M2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导重组蛋白获得表达,通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,利用Western blot鉴定重组蛋白免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫20日龄的禽流感非免鸡,以人工合成的M2e与KLH偶联后免疫鸡作为阳性对照,以pET-32a(+)载体蛋白注射组作为阴性对照,初免后2周加强免疫。通过抗M2e抗体检测、 细胞病变抑制试验与间接免疫荧光试验评价重组蛋白免疫后产生的体液免疫反应; 利用流式细胞分群及细胞因子产量检测评价重组蛋白免疫后产生的细胞免疫反应。加强免疫后4周用100EID50的H9N2亚型AIV攻毒,通过Real-time PCR检测攻毒后3、5、7天免疫鸡泄殖腔棉拭子中病毒的含量。结果表明,重组蛋白3M2e hsp70免疫组能够刺激免疫鸡产生较高的抗体水平及细胞免疫应答,并且攻毒后泄殖腔棉拭子中病毒含量明显降低。     

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变, 然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET-28a(+)中,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下, 重组转化菌可高效表达目的基因, 表达量平均可达菌体蛋白总量的28%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。此重组蛋白免疫的家兔可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。     

蜱传脑炎病毒衣壳蛋白的可溶性表达、纯化及初步应用

目的 构建蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)衣壳蛋白(capsid protein, C)原核表达质粒,并以其表达、纯化的C蛋白作为抗原检测临床血清,评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis, TBE)临床血清学诊断中的应用。方法 登录Genbank对TBEV“森张”株C蛋白基因序列设计扩增引物,以PCR扩增C蛋白目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a(+)后,构建重组表达质粒pET-32a-C。再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导剂诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以制备的C蛋白作为包被抗原,用间接ELISA分别检测20份TBEV IgG抗体阳性临床血清、10份流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)阳性临床血清及20份阴性血清,并计算检测的特异性和敏感度。结果 重组表达质粒pET-32a-C序列测定正确;经12%SDS-PAGE电泳分析,重组C蛋白主要为可溶性蛋白表达;纯化...     

人源酪蛋白激酶Ⅱ催化亚基的构建及表达纯化

目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人源csnk2a1和csnk2a2目的基因片段,将酶切连接得到的重组质粒经测序验证后,进行大肠杆菌感受态BL21 (DE3)/Transetta (DE3)转化。使用合适浓度IPTG诱导融合蛋白的表达以得到可溶性的融合蛋白,并应用AKTA avant蛋白纯化仪和Ni2+-NTA预装柱进行纯化,蛋白纯度最后经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色和Western Blot检测鉴定。结果:测序结果表明pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒均成功被构建;经转化诱导表达后,成功纯化得到相对分子量为42KD的his-hcsnk2a1和38KD的his-hcsnk2a2目的融合蛋白。结论:首次成功构建得到pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒;并表达纯化得到高浓度和高纯度的his-hcsnk2a1和his-hcsnk2a2融合蛋白,为后期的蛋白功能研究和抑制剂筛选评价提供了基础。     

抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定

[目的]制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV) sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.[方法]以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化.用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体.用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性.[结果]Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体.[结论]制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定.     

沙眼衣原体L2型主要外膜蛋白的原核表达及其抗原性分析

克隆表达沙眼衣原体(Ct)L2血清型的主要外膜蛋白(MOMP)基因,并鉴定重组MOMP(rMOMP)的抗原性,为进一步研究Ct感染的诊断和预防技术奠定基础。应用PCR技术对CtL2型标准株的MOMP基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a(+),成功构建了rMOMP-pET-32a(+)表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后摇菌进行rMOMP的诱导表达、鉴定和纯化,免疫印迹和ELISA法分析显示rMOMP可与兔源抗CtL2多克隆抗体发生特异性反应,表明rMOMP具有良好的抗原性。     

空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。     

猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白VP0与VP1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白VP0与VP1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20 000和1∶15 000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。     

猪源马链球菌兽疫亚种表达的类M蛋白黏附抑制性单抗的获得

根据马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)猪源株ATCC35246株的类M蛋白基因序列,通过PCR技术,扩增出无信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a( )中。重组质粒经酶切鉴定和测序后,在大肠杆菌BL21中表达,获得60kDa产物,Western blot显示,其与ATCC35246株多克隆抗血清反应,抗原性良好。以His亲和层析柱纯化重组类M蛋白作为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株,特异性检测显示其与A群链球菌、猪链球菌2型以及马链球菌马亚种等没有交叉反应。单抗亚类鉴定显示,其中6株为IgG1,3株为IgG2,另外3株为IgM。从腹水中纯化的单抗效价为2.56×104~1.01×105。黏附抑制实验显示,其中一株单抗能阻断类M蛋白黏附HEp-2细胞。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

家蚕蚕丝蛋白轻链基因克隆及原核表达研究

克隆家蚕丝素蛋白轻链基因并构建原核表达系统。以家蚕总RNA反转录cDNA为模板,利用特异性引物FiblF和FiblR扩增编码丝素蛋白轻链基因(Fibl)765bp片段,以pET-28a(+)构建pET-28a(+)-Fibl表达载体,将重组表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞构建产丝素蛋白轻链(Fibl)蛋白工程菌。构建了原核表达载体pET-28a(+)-Fibl,经测序验证基因序列正确,经聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot初步判断出表达产物为35.3KD的丝素蛋白轻链蛋白。成功构建产丝素蛋白轻链蛋白的工程菌BL21-pET-28a(+)-Fibl,为丝素蛋白的原核表达研究奠定了基础。     

香菇C_(91-3)转录本Unigene8290基因结构域片段的克隆表达及其抗肿瘤活性初步研究

目的通过对香菇C91-3转录组进行筛选,并克隆表达含RCC1(染色体浓缩调控蛋白)和ANK(锚蛋白)结构域的Unigene8290基因,研究其抗肿瘤活性。方法从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成cDNA,并利用Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)技术获得基因全长。生物信息学分析其结构域。设计特有引物,采用PCR技术扩增该结构域,将其克隆产物与pET-32a(+)载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami(DE3)中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果生物信息学显示Unigene8290基因具有RCC1和ANK结构域,琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示Unigene8290基因的结构域片段与pET-32a(+)载体重组成功,SDS-PAGE与Western blot结果显示Unigene8290蛋白成功表达,MTT结果显示该重组融合蛋白对HepG2细胞生长具有明显的抑制作用,并且其抑制作用存在一定的时间和浓度依赖性。结论成功诱导Unigene8290的RCC1和ANK结构域蛋白表达,并初步鉴定其具有抑制HepG2肿瘤细胞增殖活性的功能。     

空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素B蛋白(CdtB),制备其单克隆抗体(mAb),并研究mAb抗毒性作用。【方法】扩增空肠弯曲菌cdtB基因并将其构建到pET-30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,以原核表达的GST-CdtB蛋白为免疫原,应用杂交瘤技术进行细胞融合;采用间接ELISA方法测定细胞上清和mAb腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性,并以CaCo-2和HD-11细胞为模型,鉴定mAb抗毒性能力。【结果】成功构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-cdtB和pGEX-6p-1-cdtB,并融合表达rHis-CdtB和rGST-CdtB蛋白。获得5株稳定分泌CdtB抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F3,1F5,2E4,2E11,2F2。抗体Ig类和亚类检测显示2E11 Ig亚类为IgG2b,其他4株均为IgG1。抗体效价高达1:(1×108)。Dot-ELISA试验表明5株mAb均能与空肠弯曲菌标准株发生特异性反应,与非空肠弯曲菌呈阴性反应;Western blot法分析表明5株mAb均能与纯化蛋白rGST-CdtB有良好的反应性。基于CaCo-2细胞的黏附和侵袭实验表明mAb能显著降低细菌的黏附和侵袭能力(P0.01)。【结论】成功制备了针对空肠弯曲菌CdtB蛋白的mAb。为进一步研究空肠弯曲菌致病机制,以及为研制治疗性类药物奠定了基础。     

猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较

干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质,主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)α、γ、αγ及ω基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-α、pET-His/PoIFN-γ、pET-His/PoIFN-αγ和pET-His/PoIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明猪α和αγ融合干扰素有较为显著的抗病毒活性,抗PRRSV活性高达108U/mg;猪γ干扰素活性效价约为α干扰素的1/2到1/3;猪ω干扰素几乎未检测到抗病毒活性,需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。