一个小麦丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm2 1的小麦 (TriticumaestivumL .)_簇毛麦 (Haynaldiavillosa)6VS/ 6AL易位系 92R137中分离与抗白粉病相关的基因 ,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆。序列分析表明 ,它与大豆 (Glycinemax (L .)Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源。经推测 ,TaPK1编码 416个氨基酸的多肽 ,属丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶家族 ,并具酪氨酸激酶特性。TaPK1是从小麦中分离的新基因。     

受体丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶

近几年证实有几种受体具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性,它们都为单一的跨膜蛋白,胞外部位较小,胞内含有公认的丝氨酸／苏氨酸激酶的共同序列,为一类新发现的受体型激酶,TGF－β受体I,II型为典型的受体丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它们在传递胞外信息时可能要比受体酷氨酸激酶复杂,需要几种受体共同作用才能完成。     

小麦CBL结合蛋白激酶基因TaCIPK16的克隆及特征分析

类钙调磷酸酶亚基B蛋白(calcineurin B-1ike protein,CBL)作为一类钙离子结合蛋白,通过与一类蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,ClPK)结合,从而在钙信号依赖的生理生化过程中发挥作用。该研究在条锈菌诱导的小麦叶片中克隆获得CIPK家族中1个基因TaCIPK16,并利用qRT-PCR技术、酵母双杂交技术及亚细胞定位技术分析了其功能特性。序列分析表明,TaCIPK16编码447个氨基酸,包含保守的激酶催化结构域及调控结构域,与水稻、拟南芥CIPK蛋白具有高度相似性。酵母双杂交分析验证显示,TaCIPK16与TaCBL4和TaCBL9存在强烈互作。定量分析表明,TaCIPK16受到条锈菌的诱导表达,在小麦与条锈菌互作过程中呈显著差异表达趋势。综上结果,TaCIPK16可能作为正调控因子参与了小麦对条锈菌的抗病防卫反应。     

分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究

【目的】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝杆菌类似真核样的蛋白激酶,预测在分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程中起着重要的作用,解析PknK的生物功能及作用机制,将为结核病的防治提供一定的理论基础。【方法】通过基因敲除等遗传方法获得结核分枝杆菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回补菌株pMV361-pknK/△pknK和过表达菌株pMV261-pknK/BCG;对获得的菌株进行生长曲线测定和抗药性分析;通过pulldown-MS方法及生物信息学方法鉴定了PknK相互作用蛋白。【结果】监测各种分枝杆菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生长,确定PknK负调控BCG生长;抗药性分析显示PknK降低BCG的耐药性;pulldown-MS方法显示PknK与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和双组分系统中的反应调节因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【结论】研究发现PknK调控分枝杆菌的生长和耐药性,我们的研究为深入研究PknK在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础。     

普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析

为研究抗白粉病小麦（Triticum aestivum L．）品系在小麦白粉病菌（Blumeria graminis f. sp．tritici）侵染后有无LRK10同源基因表达,依据小麦蛋白激酶LRK10和其它植物蛋白激酶第6亚结构域设计了一个5’-RACE兼并性引物。以接种小麦白粉病菌后的小麦抗白粉病品系“99—2439”幼苗叶片cDNA为模板进行5’-RACE扩增,获得了一个1551bp长的蛋白激酶基因cDNA片段（S1125,GenBank登录号：AY584533）。此后,通过RACE技术成功地获得了该基因的全长cDNA克隆。该克隆编码637个氨基酸组成的多肽。同源性查寻表明,该基因属于先前命名为wfrk（wheat leaf rust kinase）的小麦类受体蛋白激酶基因家族。与LRK10相似,这个新的小麦类受体蛋白激酶有5个明显的功能域：位于氨基端的疏水信号序列、推测的胞外结构域、跨膜域、高荷电序列和位于羧基端的丝氨酸／苏氨酸激酶域,因此被命名为TaLRK（Triticum aestivum LRK）。以小麦肌动蛋白基因为对照,通过半定量反转录PCR（semi—QRT—PCR）技术对叶片中TaLRK基因在小麦白粉病菌接种后的转录水平表达谱进行了研究。结果表明,小麦白粉病菌的侵染使TaLRK基因的转录显著增强。组织特异性表达分析证明,这一基因仅在小麦的绿色部分表达。研究结果提示TaLRK可能参与了小麦的抗白粉病反应。     

植物和小麦蛋白激酶的研究现状

蛋白激酶是酶中的一个大家族,在诸如发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病反应中起重要作用。植物,尤其是小麦的蛋白激酶研究远远落后于人类和动物。为了促进小麦蛋白激酶的研究,本文对植物和小麦蛋白激酶的研究现状进行了综述。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT2的体外激酶活性分析

目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.     

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel＿HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利...     

稻属中一个高度保守和组成型表达酪氨酸丝氨酸-酸酸双特性蛋白激酶基因的克隆与分析

从水稻中克隆了一个在稻属植物中高度保守和组成型表达的丝氨酸􊄯苏氨酸蛋白激酶基因(OsSTK)。该基因包含两个外显子和一个114 bp 的小内含子序列, 预测编码一个419 个氨基酸的蛋白质。该基因推导的氨基酸序列与其它已知序列的一致性均低于52%。利用从不同种和类型的野生稻克隆的部分该基因序列构建的系统树与野生稻的分类和进化关系相一致。OSPK N-端拥有一段富含丝氨酸、碱性氨基酸和带电荷氨基酸的特异性导肽序列, 其中包含“GDGDGDGDG”短重复序列。由于该基因蛋白激酶结构域中的VIb , VIII 和XI 亚结构域中同时具有酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸􊄯苏氨酸蛋白激酶的特性, 推测该基因可能同时具有催化酪氨酸和丝氨酸、苏氨酸磷酸化的双重功能。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在结核分枝杆菌致病机制中的作用

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STPK)是一类真核细胞样的蛋白激酶,是分枝杆菌生长和代谢的重要调节因子,参与其多种细胞活动(如细胞和菌落形态、葡萄糖和谷氨酰胺转运、吞噬体-溶酶体融合、转录因子活性等)的调节.结核分枝杆菌编码产生11种STPK( PknA、PknB、PknD～PknL),可分为5群(ABL群、HED群、FIJ...     

一个新的鼠STE20家族激酶的克隆和鉴定

从鼠肝cDNA文库克隆了一个新的STE20类蛋白激酶,Mess1.其cDNA长1.7 kb,编码了一个497个氨基酸残基的多肽,与人MST2具有95%的氨基酸相同.Mess1蛋白氨基末端激酶催化区的序列与STE20同源,其羧基末端包含了一簇丝氨酸/苏氨酸和谷氨酸丰富的序列,被认为具有介导与SH2功能区结合的作用.MESS1可能通过与含有SH2功能区的蛋白质相互作用参与细胞内信号转导.     

Expression and Characterization of the Streptomyces coelicolor Serine/Threonine Protein Kinase PkaD

We identified and characterized the gene encoding a new eukaryotic-type protein kinase from Streptomyces coelicolor A3(2) M145. PkaD, consisting of 598 amino acid residues, contained the catalytic domain of eukaryotic protein kinases in the N-terminal region. A hydrophobicity plot indicated the presence of a putative transmembrane spanning sequence downstream of the catalytic domain, suggesting that PkaD is a transmembrane protein kinase. The recombinant PkaD was found to be phosphorylated at the threonine and tyrosine residues. In S. coelicolor A3(2), pkaD was transcribed as a monocistronic mRNA, and it was expressed constitutively throughout the life cycle. Disruption of chromosomal pkaD resulted in a significant loss of actinorhodin production. This result implies the involvement of pkaD in the regulation of secondary metabolism.     

小麦硫代硫酸硫转移酶类似基因的克隆与定位

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137含有抗白粉病基因Pm21。为了研究该易位系的抗病机理,应用mRNA差异显示和快速扩增cDNA未端（Rapid Amplification of cDNAEnd,RACE)技术对在白粉菌诱导后表达增强的基因进行了克隆,分离到1个命名为TaTST的全长cDNA序列。Northern杂交分析表明,TaTST基因在白粉菌诱导后表达明显增强,24h达到峰值,氨基酸序列同源性分析表明,TaTST与Datisca glomerata的硫代硫酸硫转移酶基因（rho-danese,EC,2.8.1.1)序列有64%相同,80%相似,用中国春缺体/四体系和端体系Southern杂交和基因特异性引物扩增（gene specific primer-PCR)将TaTST基因定位在小麦6B染色体短臂上,Southern杂交表明,该基因为单拷贝基因,由于在杨麦5号和6VS/6AL易位系间存在明显多态,可以推测在6VS上有TaTST的同源基因,TaTST是从小麦中分离的新基因。白粉菌诱导后的表达变化提示;TaTST与小麦抗白粉病反应有关。     

一种新型丝氨酸苏氨酸激酶CPK的初步克隆及功能

从人胎肝cDNA文库中分离到一种cDNA ,推测的蛋白氨基酸序列具有明显的丝氨酸苏氨酸激酶结构域,可能编码一种新的丝氨酸苏氨酸激酶(命名为CPK ,cellproliferationassociationkinase) .CPKmRNA全长约3 0kb .RT PCR检测表明CPKmRNA在增殖活跃组织或细胞如人胚胎组织、肿瘤细胞株中呈高丰度表达,在成人组织则呈低丰度或不表达.利用PCR技术扩增大鼠同源cDNA ,以此为探针,Northern杂交发现CPK表达于多种成年小鼠组织,以脑组织丰度最高.小鼠2 3肝部分切除可迅速诱导CPKmRNA的表达,在术后2 4～4 8h达高峰,与2 3肝部分切除后细胞增殖期吻合.以小鼠同源cDNA片段为模板,合成RNA探针,原位杂交显示在胚胎发育期CPK低丰度表达在大多数组织,以神经系统组织变化最大,在第8d胚胎神经管内皮细胞中即出现表达,11～13d在端脑、脑膜、间脑、脊神经节表皮细胞、海马、小脑神经胶质细胞等多种神经细胞中表达且丰度较高,16d后这些组织的表达迅速下降到较低水平,表明CPK可能与神经系统的生长发育有一定关联.利用信号通路检测技术,观察到CPK的表达对MAPK ,p38MAPK途径的激活有明显的影响,并可显著增强表皮生长因子对这两条途径的激活,提示该激酶可能参与细胞因子的信号转导.     

小麦Na^＋／H^＋反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻 (OryzasativaL .)Na /H 反转运蛋白cDNA片段为探针 ,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了 2个小麦Na /H 反转运蛋白基因 ,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。序列分析表明TaNHX1为 2 0 2 9bp ,包含一个完整的 16 38bp的ORF ,编码 5 4 6个氨基酸 ,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区。TaNHX2为 16 93bp ,包含部分ORF及 80 8bp的 3′_UTR。这 2个基因与已知的水稻、拟南芥 (Arabidopsisthialiana)和滨藜 (Atriplexgmelini)中的同类基因NHX的相似性约为 70 %。RT_PCR分析表明小麦苗经 4 0 0mmol/LNaCl处理 1h后 ,TaNHX1的转录水平有所提高。     

Genome-Wide Analysis and Experimentation of Plant Serine/ Threonine/Tyrosine-Specific Protein Kinases

Protein tyrosine phosphorylation plays an important role in cell growth, development and oncogenesis. No classical protein tyrosine kinase has hitherto been cloned from plants. Does protein tyrosine kinase exist in plants? To address this, we have performed a genomic survey of protein tyrosine kinase motifs in plants using the delineated tyrosine phosphorylation motifs from the animal system. The Arabidopsis thaliana genome encodes 57 different protein kinases that have tyrosine kinase motifs. Animal non-receptor tyrosine kinases, SRC, ABL, LYN, FES, SEK, KIN and RAS have structural relationship with putative plant tyrosine kinases. In an extended analysis, animal receptor and non-receptor kinases, Raf and Ras kinases, mixed lineage kinases and plant serine/threonine/tyrosine (STY) protein kinases, form a well-supported group sharing a common origin within the superfamily of STY kinases. We report that plants lack bona fide tyrosine kinases, which raise an intriguing possibility that tyrosine phosphorylation is carried out by dual-specificity STY protein kinases in plants. The distribution pattern of STY protein kinase families on Arabidopsis chromosomes indicates that this gene family is partly a consequence of duplication and reshuffling of the Arabidopsis genome and of the generation of tandem repeats. Genome-wide analysis is supported by the functional expression and characterization of At2g24360 and phosphoproteomics of Arabidopsis. Evidence for tyrosine phosphorylated proteins is provided by alkaline hydrolysis, anti-phosphotyrosine immunoblotting, phosphoamino acid analysis and peptide mass fingerprinting. These results report the first comprehensive survey of genome-wide and tyrosine phosphoproteome analysis of plant STY protein kinases.     

Latent Periodicity of Serine/Threonine and Tyrosine Protein Kinases and Other Protein Families

A method of noise decomposition has been developed. This method allows for the identification of a latent periodicity with symbol insertions and deletions that is specific for all or most amino acid sequences belonging to the same protein family or protein domain. The latent periodicity has been identified in catalytic domains of 85% of serine/threonine and tyrosine protein kinases. Similar results have been obtained for 22 other protein families. The possible role of latent periodicity in protein families is discussed.__________Translated from Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 39, No. 3, 2005, pp. 420–436.Original Russian Text Copyright © 2005 by Laskin, Kudryashov, Skryabin, Korotkov.