MLC_2-糜酶融合基因克隆及转基因小鼠的产生

为研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系,并提高糜酶基因在小鼠心脏中的表达,构建肌球蛋白轻链－２启动子（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ－２ｐｒｏｍｏｔｅｒ,ＭＬＣ２）－糜酶融合基因并产生转基因小鼠．通过删除糜酶基因启动子序列,构建结构基因克隆,然后与大鼠心脏肌球蛋白轻链－２启动子序列相拼接,构建ＭＬＣ２－糜酶融合基因克隆,回收并纯化融合基因片段,显微注射入小鼠受精卵产生转基因小鼠,经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交和ＰＣＲ扩增产物的测序,筛选和确定转基因鼠．在新出生的４６只小鼠中有２只为转基因阳性鼠,且外源基因能稳定遗传给后代,从而获得了可用于研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系的转基因小鼠模型．     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性条件敲除研究的关键。采用PCR扩增大鼠胰岛素基因705bp启动子指导发胰岛细胞中特异表达;同时采用改构的Cre重组酶基因,在其5'端添加有真核核糖体结合序列和核定位序列使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核能发挥功能;同时,为了保证原核基因Cre能在真核系统顺利表达,在其3'端添加含内含子的人生长激素基因。构建的表达载体在去除原核序列后用显微注射方法转基因小鼠,在出生的27只仔鼠中,PCR检测共获得7只Cre整合阳性的转基因小鼠,整合率26％。这种Cre转基因小鼠与基因组小携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,在胰腺组织中可以检测到Cre介导的重组,表明Cre在转基因小鼠胰腺中有表达。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β-乳球蛋白基因(BLG)作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工具,构建了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,经PCR和Southern\|Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG-tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汁中检测到tPA的活性,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合在小鼠基因组中的牛BLGtPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL。这为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据。     

糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶9的活化

为研究糜酶在心脏中的功能 ,用明胶酶谱法和放免法检测了糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶及糜酶的活力 .糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶样活力较转基因阴性小鼠升高了约80 % ;而其心脏匀浆液凝胶酶谱分析结果显示在 92 k D处明胶酶活力也升高约 30 % ;经 Western印迹鉴定为基质金属蛋白酶 9,而在蛋白水平上与转基因阴性小鼠无显著差异 .结果提示 ,糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶活力的升高可活化基质金属蛋白酶 9,从而影响心脏胶原代谢 .     

不同方向内含子对重组CHO细胞中神经生长因子表达的影响

为了研究不同方向的嵌合体内含子对重组神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF) 基因表达的影响,以人β-珠蛋白第一内含子5?端剪接序列和人免疫球蛋白重链可变区内含子3?端剪接序列组合而成的嵌合体内含子作为研究对象,在NGF基因5?端插入不同方向的嵌合体内含子,构建含不同方向内含子的NGF基因表达载体。转染至CHO细胞后,G418筛选稳定转染的细胞,荧光定量PCR、ELISA和Western blotting检测不同载体NGF基因的表达情况。结果显示内含子可以大幅度提高NGF基因的表达,且正向内含子对NGF基因表达的增强作用无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都要高于反向内含子。所以内含子能够提高外源NGF基因的表达,且内含子调控转基因表达具有方向性。     

竞争性PCR检测MLC_2-糜酶融合基因在转基因小鼠中的组织特异性表达

 用竞争性 Ｐ Ｃ Ｒ 方法定量检测了大鼠肌球蛋白轻链 ２ 启动子（ｍ ｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２ ｐｒｏｍ ｏｔ ｅｒ, Ｍ Ｌ Ｃ２） 糜酶（ｃｈｙｍ ａｓｅ）融合基因在转基因小鼠不同组织中的表达情况,发现 Ｍ Ｌ Ｃ２ ｃｈｙｍ ａｓｅ融合基因在转基因小鼠的心脏中有较高水平的表达,在骨骼肌中表达水平较低,在肾脏中有微弱表达;而在肝脏和肺中未检测到．表明 Ｍ Ｌ Ｃ２ ｃｈｙｍ ａｓｅ 融合基因改变了野生型 ｃｈｙｍ ａｓｅ 在生物体内的表达特性,不仅提高了表达效率,而且赋予了一定的心脏组织特异性,为进一步研究 ｃｈｙｍ ａｓｅ 基因在心脏中的功能奠定了基础．     

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位,应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明,外源基因是以单拷贝、单位点形式整合;应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明,该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区;反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示,获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代.     

高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响

目的:探究高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响,为研究NYD-SP15在生物体中的功能提供动物模型。方法:将人源NYD-SP15 cDNA以及Cre序列插入PCAG启动子下游,构建NYD-SP15转基因表达载体,并通过原核注射,构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配,PCR鉴定转基因小鼠是否有Cre插入,筛选出人源NYD-SP15表达的小鼠,统计转基因小鼠体重变化和后代阳性情况。结果:通过PCR鉴定及公司测序验证,我们成功构建了NYD-SP15转基因过表达载体。并通过PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以表达人NYD-SP15的转基因小鼠。比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现转基因小鼠体重与同窝野生型小鼠相比无明显区别,说明在体内过表达NYD-SP15对小鼠体重无明显影响。通过对后代阳性小鼠出生情况统计发现F2代阳性小鼠出生率较F1代明显降低。结论:人源NYD-SP15在小鼠体内能正常表达,对其生长无明显影响,但其后代阳性出生率呈逐代下降趋势,推测该原因可能与NYD-SP15在睾丸中表达有关。     

重组PCR技术的应用及优化

重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用,使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。它使基因全序列的拼接、基因融合、基因破坏及启动子交换等DNA操作变得简单易行。如今重组PCR已成为DNA分析的有效利器。本研究通过重组PCR在分子进化、基因敲除及基因敲入、启动子研究和转基因植物转化载体的构建等方面的实际应用,分析了该技术的影响因素,并针对引物设计、DNA碱基重叠长度、温度参数等重要反应条件提出了优化方案。     

大黄鱼白细胞介素8基因克隆及特征分析

白细胞介素8是一种CXC型趋化性细胞因子,在免疫反应中起着非常重要的作用。本文在构建大黄鱼肌肉组织cD-NA文库的基础上,克隆了白细胞介素8基因。克隆到的白细胞介素8全长为2582bp,基因组包含106bp的5’端非编码区,52bp的外显子Ⅰ,168bp的内含子Ⅰ,133bp的外显子Ⅱ,149bp的内含子Ⅱ,87bp的外显子Ⅲ,682bp的内含子Ⅲ,13bp的外显子Ⅳ和1192bp的3’端非编码区,编码序列285bp,编码94个氨基酸。氨基酸序列具有趋化性因子CXC家族的结构特征,在进化上高度保守,与鲈鱼的同源性在90％以上。在检测的大黄鱼的10种组织中,表达量较高的为肾、肝、肠和脾,脑、心和肌肉中表达量较低。