三七转录因子PnWRKY1对三七皂苷生物合成的影响

该研究以野生型三七为材料,采用同源克隆的方法,获得三七转录因子PnWRKY1基因,运用农杆菌转化法构建转基因细胞系,通过测定转基因细胞系中的总皂苷含量以及重要单体皂苷的含量,并采用qRT-PCR分析皂苷合成途径中相关基因的表达情况,为三七皂苷生物合成高效调控策略的建立提供理论依据。结果显示:(1)转录因子PnWRKY1长度为810bp,编码269个氨基酸。(2)成功构建PnWRKY1过表达载体pCAMBIA2300sPnWRKY1,经农杆菌转化获得了6株具有卡那霉素抗性的转基因细胞系(T_1~T_6),对卡那霉素基因nptⅡ进行PCR检测表明,所有细胞系均有与预期大小一致的450bp特异性条带,说明成功获得了6株PnWRKY1过表达转基因细胞系。(3)6株转基因细胞系中的PnWRKY1表达水平均极显著高于野生型细胞系,其中表达量最高的T_3细胞系比野生型增加了5.36倍。(4)过表达PnWRKY1基因细胞系的总皂苷生物合成均得到显著提高,其中T_1~T_6中总皂苷含量分别为野生型细胞系的2.46、1.98、2.67、1.74、2.54和1.98倍;6株过表达PnWRKY1细胞系中的4种单体皂苷R1、Rg1、Re、Rb1的含量与野生型细胞系相比均有不同程度的提高,且T_3细胞系中的单体皂苷Re含量最高(37.81mg/g)。(5)与野生型细胞系(WT)相比,过表达PnWRKY1细胞系中三七皂苷合成途径中的关键酶基因PnDS、PnSS和PnSE的最高表达水平分别增加3.1、4.0和4.5倍。研究表明,转录因子PnWRKY1在三七细胞中的过表达可能参与调节皂苷生物合成部分重要酶基因的表达,且PnWRKY1可能通过调控三七皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达间接影响三七皂苷的合成。     

复合调控Wx与SBE3基因对水稻籽粒直链淀粉含量的影响

颗粒淀粉合成酶（GBSS）和淀粉分支酶3（SBE3）是淀粉合成过程中的两个关键酶,这两个酶主要由耽和SBE3两个基因分别控制,它们的表达量直接影响直链淀粉和支链淀粉的含量比例。为了探讨水稻淀粉关键酶基因耽过量与SBE3干涉复合表达对直链淀粉含量的影响,构建了Wx过量表达与SBE3干涉结合的多基因表达载体,并通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴水稻中。经过PCR检测分析获得了65株转基因阳性植株,半定量RT—PCR检测表明转基因株系中Wx基因表达量明显增加,而SBE3基因表达量显著减少。转基因株系籽粒透明度明显降低,直链淀粉含量比野生型的平均高45％,但是千粒重变化不大,与野生型相当。遗传分析表明这些转基因株系多数可稳定遗传。     

珠子参中法尼基焦磷酸合酶(FPS)对皂苷生物合成的影响研究

珠子参作为名贵中草药已有上千年应用历史,珠子参皂苷是珠子参的主要活性成分,由达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成。目前,对珠子参皂苷的生物合成了解甚少,有必要开展与皂苷合成相关的基础研究工作。已有报道表明,法尼基焦磷酸合酶（FPS）可能是植物中皂苷合成的关键酶。本研究克隆了珠子参FPS基因（PjFPS）的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。基于PjFPS序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjFPS,将其转化到珠子参细胞中,成功获得阳性转基因细胞;测定了阳性细胞系中PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷以及植物甾醇含量的变化。结果表明,与野生型珠子参细胞相比,PjFPS转基因珠子参细胞系中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活以及皂苷含量均有不同程度的提高。而且,由于皂苷合成代谢流的增加,也促进了相关重要关键酶基因的表达。在效果最好的阳性细胞中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷含量分别为对照的12、4和3倍;同时,转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高。本研究通过对皂苷合成途径关键酶基因的调控实现了对皂苷生物合成的调节,为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据。     

珠子参中HMGR基因对皂苷生物合成的影响

该研究以珠子参愈伤组织为材料,通过同源克隆方法获得了珠子参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因(PjHMGR,登录号:MG712296)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。基于PjHMGR序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjHMGR,通过根瘤农杆菌转化法将其转化到珠子参细胞中,成功获得7株阳性转PjHMGR基因细胞系;通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定阳性细胞系PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活、皂苷和植物甾醇含量变化。结果显示:(1)与野生型珠子参细胞系相比,转PjHMGR基因珠子参阳性细胞系中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量均有不同程度的提高;在效果最好的阳性细胞中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量分别为对照的7.15、6.14和3.50倍。(2)在研究过程中,发现转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高。研究认为,将珠子参关键酶基因PjHMGR过表达载体导入珠子参愈伤组织细胞中,可引起相关关键酶基因相对表达量和PjHMGR酶活性的增加,从而调控珠子参总皂苷的合成,对皂苷合成途径中关键酶基因进行调控将可能实现对皂苷生物合成的调节。     

超量表达AtBAS1基因对烟草中烟碱和降烟碱合成的影响

为明确拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phy B activation-tagged suppressor1,BAS1)基因对烟草(Nicotiana tabacum)中烟碱、降烟碱和N-亚硝基降烟碱合成的影响,通过构建含有不同启动子的植物表达载体p SH-p LXM5-BAS1和p SH-35S-BAS1遗传转化烟草。在8~10叶期分别取转基因和野生型烟草植株相同部位的叶片,采用LC-MS方法对样品中烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱含量进行测定,结果表明转基因烟草烟碱含量和降烟碱含量与野生型相比均明显提高。转p LXM5-BAS1基因和转35S-BAS1基因植株烟碱含量分别是野生型植株2.9倍和2.95倍;同时测得降烟碱含量分别为野生型的3.35倍和3.76倍;在转基因和野生型烟草中均未检测到亚硝基降烟碱。表明超量表达At BAS1对烟草的烟碱和降烟碱合成存在显著影响。据NCBI数据库中报道的烟碱合成相关基因PMT和QPT,降烟碱合成相关基因CYP82E4v1、CYP82E5v2、CYP82E10的序列,设计各基因的Real-time PCR引物,并以烟草β-Actin基因作为内参,Real-Time PCR结果表明烟碱和降烟碱合成相关基因表达均出现不同程度的上调。综上可知,在烟草中超量表达At BAS1基因,促使烟碱和降烟碱合成相关基因表达的上调,直接导致了烟草中烟碱含量和降烟碱含量的大幅提高。本研究为后续深入挖掘影响烟碱及降烟碱生成及转化的新基因并最终构建完整的烟碱代谢网络提供了借鉴,也为研究烟碱向降烟碱转化过程中信号因子和信号传递提供了一个新途径。     

异源表达CiRS基因通过生成白藜芦醇增强拟南芥的抗氧化能力

白藜芦醇是一种具有多种医疗保健作用的植物芪类次生代谢产物,在农业、医药、食品和化妆品等领域受到广泛的关注。白藜芦醇合酶是白藜芦醇生物合成中唯一必需的关键酶,决定植物体内白藜芦醇的合成。将中间锦鸡儿中克隆到的CiRS基因(Gen Bank登录号MF678590)转入野生型拟南芥,实验结果显示:野生型的总黄酮含量明显高于转基因株系。HPLC测得转基因拟南芥中有白藜芦醇的生成,并且含量最高达335μg/g FW。紫外照射处理后转基因植物中丙二醛的积累量明显少于野生型。转基因植物提取物DPPH自由基清除能力均高于野生型。这些结果表明,中间锦鸡儿CiRS基因异源表达后利用与黄酮类物质的共同底物合成了白藜芦醇,使得转基因植物的抗氧化性增强。     

杨树HDA902基因在低温胁迫应答反应中的功能

组蛋白去乙酰化酶在植物非生物胁迫应答反应中具有重要的调控作用。利用RT-PCR的方法从毛果杨中克隆了组蛋白去乙酰化酶基因HDA902。利用农杆菌介导法将其遗传转化到烟草中,并对转基因植株进行低温耐受性分析。研究结果表明,HDA902在烟草中的表达显著提高了转基因株系对低温的耐受性。叶片NBT和DAB染色结果表明,在低温处理后转基因烟草比野生型烟草产生较少的活性氧。丙二醛和脯氨酸含量测定结果表明,在低温条件下,转基因烟草叶片的脯氨酸含量显著高于野生型烟草,而丙二醛含量显著低于野生型烟草。这些研究结果表明,HDA902参与低温胁迫应答反应,其过量表达提高了植株耐低温的能力。     

SmGGPPS2对丹参酮合成的影响

香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是植物二萜类次生代谢物合成过程中的重要调控位点。在药用模式植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中, GGPPS基因家族成员SmGGPPS2的生物学功能及其在丹参酮有效成分合成过程中的作用尚不明确。分别在丹参植株中过表达和RNA干涉SmGGPPS2基因, 并对转基因丹参中丹参酮含量和丹参酮合成相关基因表达量 以及转基因植物生理指标进行检测, 结果表明, 过表达SmGGPPS2株系中的丹参酮IIA和铁锈醇等脂溶性成分含量高于野生型; RNA干涉SmGGPPS2株系中的丹参酮IIA和铁锈醇等脂溶性成分含量均低于野生型。调节表达SmGGPPS2后, 丹参株系中SmHMGR1和SmCPS1等多个关键酶基因的表达都呈现明显的变化。此外, 调节表达SmGGPPS2还影响丹参植株抗性。以上结果表明, SmGGPPS2在丹参酮等萜类物质的合成中起重要的调控作用。     

蔗糖合酶基因AtSUS3干涉后对拟南芥角果发育的影响

蔗糖合酶(SuSy)是植物蔗糖代谢关键酶之一,该研究利用反向遗传学手段,采用RNAi技术抑制拟南芥中AtSUS3基因的表达,测定纯系转基因植株的抽苔率,并对酶活性、糖含量等指标以及糖代谢相关基因的表达进行了检测,探讨SuSy在植物发育中的作用。结果显示:(1)转基因拟南芥的抽苔平均早于野生型植株2～3d,且优先3～4d完成抽苔。(2)开花后生长天数对角果蔗糖和葡萄糖含量有显著影响,而对果糖含量影响不显著;开花后5d时,野生型株系的葡萄糖含量显著高于转基因株系SUS3-2,至15d时,两种转基因株系葡萄糖含量均显著低于野生型株系。(3)开花后生长天数对SuSy、SPS、INV的活性均有显著影响,随开花时间延长,野生型株系SuSy活性显著低于转基因株系,而SPS和INV则相反。(4)AtSUS3基因沉默对其他糖代谢基因有不同程度的影响,开花后5d时,转基因植株的角果中AtCesA1、AtCesA7和AtCINV1的表达量较野生型都有所增加;开花后15d时,转基因植株的角果中AtCesA1、AtCesA7的表达量较野生型高,而AtCINV、AtCwINV的表达量比野生型低。研究表明,拟南芥AtSUS3基因沉默后,在正常生长条件下未造成植株发育异常,同时还可能通过同源家族中其他SuSy的表达水平增加,促进了该酶及糖代谢相关基因整体水平的增加,有助于角果成熟。     

小黑杨PsnHB22基因在烟草中的遗传转化研究

HD-Zip转录因子在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要的作用，HB22转录因子是HD-ZipⅠ亚家族的成员之一。为研究PsnHB22基因的功能，从小黑杨（Populus simonii×P.nigra）cDNA中克隆PsnHB22基因并构建植物表达载体进行烟草（Nicotiana tabacum）的遗传转化，以获得该基因过量表达的转基因株系。对转基因株系进行PCR、qRT-PCR分子检测后观察表型，结果显示在营养生长时期，转基因烟草叶片窄小并且株高显著低于野生型对照。测定转基因烟草及野生型叶片的叶绿素含量，发现转基因烟草叶绿素含量显著高于野生型。由此推测PsnHB22基因在植株高生长、光合作用及叶片的形态建成等过程中起着重要的作用。     

烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用。本实验从烟草c DNA文库中克隆了NtNAC1基因,c DNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸。进化树分析结果显示,Nt NAC1基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高。农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20%PEG6000处理转基因和野生型植株7 d。结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型。RT-PCR分析结果显示,Nt NAC1基因以及Nt NAC基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型。选取T_0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析。结果发现,在300 mmol·L~(-1)甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制。这表明转Nt NAC1基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。     

褪黑素合成酶基因转化烟草及转化植株抗氧化系统变化

通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术,将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase,HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测,结果表明,AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中,并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明,转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株,证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定,并与其亲本对照植株比较,发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,谷胱甘肽(GSH)浓度...     

染色体重组对转基因大麦中gfp基因表达的作用

利用5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料,对不同转基因株系间以及转基因株系与野生型植株间进行杂交,分别对不同世代植株的根尖、花粉中gfp基因的表达量进行测定.结果表明,不同转基因株系间的根尖、花粉的gfp基因在表达量上存在差异,同一转基因材料的gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显性基因以孟德尔方式稳定遗传,不同染色体上的gfp基因重组有利于提高持基因表达.     

转CiCHS基因拟南芥的黄酮代谢及抗氧化能力分析

该研究克隆了中间锦鸡儿的查尔酮合成酶基因(CiCHS)并转入野生型拟南芥和tt4突变体,用qRT-PCR检测了转基因拟南芥中内源AtCHS基因的表达量,用分光光度法分析了转基因拟南芥的总黄酮、丙二醛含量及DPPH自由基清除能力,用HPLC法检测了转基因拟南芥的柚皮苷含量。结果显示:(1)转基因拟南芥中,内源AtCHS基因的表达量约为野生型的十分之一,总黄酮含量明显高于野生型;HPLC测得转基因株系中柚皮苷含量高于野生型;紫外照射处理前后转基因拟南芥中丙二醛积累量明显少于野生型。(2)转基因株系提取物对DPPH自由基清除能力显著高于野生型。(3)CiCHS基因互补拟南芥tt4突变体,转基因株系的种皮呈现浅棕色。研究表明,中间锦鸡儿CiCHS基因异源表达后生成了柚皮苷,使转基因植物的抗氧化性增强,部分恢复了tt4突变体的种皮颜色。     

基于关键酶靶点基因研究内生青霉P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制

为了探明刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因家族各成员中靶点基因在内生青霉P116-1a提高皂苷含量的作用机制,我们利用Real time PCR法检测了回接P116-1a对刺五加SS、SE和β-AS基因家族各成员表达的影响;应用分光光度法测定总皂苷含量变化,并以SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,回接菌株P116-1a后,SS1的表达量显著降低(p0.05),SS2呈先高后低的变化趋势。SE1的表达量显著提高(p0.05)。回接的早期,P116-1a显著抑制了SE2的表达(pAS20.05),之后回复正常。β-AS1呈现先高后低的变化趋势与SS1的变化趋势相似;β-基因的表达量显著提高(p0.05)。菌株P116-1a显著提高了刺五加的皂苷含量(p0.05)。SS2、SE1和β-AS2的表达量变化与刺五加的皂苷含量变化呈显著的正相关关系。我们初步判断,SS2、SE1和β-AS2是P116-1a提高刺五加皂苷含量的作用靶点基因。     

转popW基因烟草的构建及相关表型分析

PopW是克隆于青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721中的一种新的编码harpin蛋白的基因,原核表达的PopW蛋白能够诱导烟草对TMV的抗性、促进烟草生长、提高烟草品质。将popW基因连接到植物表达载体pBI121上,构建成重组转基因载体pB-popW,通过冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105,获得阳性转化子。再采用叶盘法转化三生烟Nicotiana tobacum cv.Xanthi nc.,经卡那霉素抗性筛选、PCR检测、RT-PCR分析获得21个株系的T3代阳性植株。PCR及RT-PCR检测结果表明popW基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平正常表达。GUS染色进一步证明popW基因在翻译水平上进行了表达,且不同株系之间表达存在差异。对烟草花叶病毒(TMV)的抗病性测定结果表明,转基因烟草对TMV的抗病性增强,防效最高达54.25%。转基因烟草在生长上也具有一定优势,生长15 d的根长最高为野生型的1.7倍,移栽后60 d的株高、鲜重、干重最高分别为野生型烟草的1.4、1.7和1.8倍。     

玉米茎特异启动子克隆及其在转基因烟草中的活性分析

从玉米自交系‘综31’基因组中分离了1个茎特异表达启动子,命名为ZmSSP。用ZmSSP替换植物表达载体pCAMBIA3301的CaMV35S启动子,构建了ZmSSP驱动GUS报告基因的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmSSP-GUS,并采用农杆菌介导法转化烟草,对转基因烟草营养器官中GUS表达模式进行了分析。结果表明:在烟草中ZmSSP活性低于CaMV35S启动子;不同转基因株系中ZmSSP活性及模式有显著差异;10个转基因株系统计结果表明,GUS表达量最高的营养器官是叶柄,平均是Actin基因表达量的2.71倍;其次是叶片和茎,在根中的GUS表达量最低,平均是Actin基因表达量的29.6%,是叶柄中活性的10.9%。研究认为,ZmSSP是较好的组织特异性启动子,适用于通过植物基因工程技术驱动目的基因进行地上营养器官的性状改良。     

苦荞R2R3-MYB转录因子调控原花青素生物合成的研究

基于苦荞花期转录组数据,该研究筛选并克隆获得一个黄酮代谢相关的MYB类转录因子,并命名为FtMYB23。该基因ORF框长879bp,编码292个氨基酸;系统进化树分析显示,FtMYB23与SG5-MYB亚家族成员聚为一簇,属于典型的R2R3-MYB型转录因子。β-半乳糖苷酶滤纸分析表明,其具有转录激活活性。FtMYB23过表达转基因拟南芥株系的表型分析表明,3个阳性株系的种皮颜色均呈现出比野生型更深的褐色,其叶中原花青素含量均极显著增加(P 0.01),分别为野生型的4.68、3.5和2.8倍。qRT-PCR分析表明,转基因拟南芥中黄酮合成相关的AtCHS、AtCHI、AtF3H、AtF3′H、AtFLS、AtDFR和AtBAN等基因的表达量显著升高(P 0.05),而AtTT12的表达量极显著降低(P 0.01)。研究认为,FtMYB23作为典型的Subgroup5-MYB(SG5-MYB)激活型转录因子,通过促进黄酮合成途径早期关键酶基因的表达,从而提高原花青素的合成与积累。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF(LEAFY同源基因)和PTAG(AGAMOUS同源基因)是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将35S::PTLF-PTAG-IR导入烟草(Nicotiana tabacum)。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL(LEAFY同源基因)和NAG1(AGAMOUS同源基因)的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明:与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S::PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。