抗肿瘤多药耐药纳米粒的制备及其对MCF-7/ADR 细胞的体外评价

目的:肿瘤的多药耐药现象会显著降低肿瘤细胞内药物浓度,本研究通过制备抗肿瘤多药耐药的靶向给药系统来逆转肿瘤的耐药性以提升细胞对药物的敏感性,从而降低该现象对癌症治疗的阻碍。方法:本文使用乳化溶剂挥发法制备以含姜黄素两亲性嵌段共聚物载体、以紫杉醇和磁性粒为核心的抗肿瘤多药耐药纳米粒,使用透射电镜和动态粒径散射仪等对纳米粒进行表征和磁响应性测试后,使用MTT法测定纳米粒对肿瘤耐药细胞MCF-7/ADR的抑制率以探究给药系统的耐药逆转性能。结果:制备的抗肿瘤多耐药纳米粒粒径为105 nm左右,磁响应性良好。所制得载紫杉醇纳米粒包封率为74.74%,载药率为12.40%。纳米粒可以通过磁场和生物素受体介导作用促进肿瘤细胞对粒子的内化,以增加抗癌药物的蓄积。与游离紫杉醇相比,逆转细胞耐药指数达8.5。结论:纳米系统在维持自身稳定性同时,能够凭借协同作用和靶向作用较大程度提升药物对耐药肿瘤细胞的杀伤效果。     

筛选MDA-MB-231乳腺癌耐药细胞株两种方法的比较

目的 比较间歇刺激法和浓度梯度递增法对雌激素受体（estrogen receptor,ER）阴性的乳腺癌耐药细胞株的建立,为进一步探讨ER阴性乳腺癌可能的耐药机制.方法 采用间歇刺激法和浓度梯度递增法,用紫杉醇诱导6个月,分别建立了耐药细胞系231 TIM10和231 TAX8,并用倒置相差显微镜、MTT法、Western印迹、流式细胞术比较了两株耐药细胞的形态学变化、耐药表型、ER-α蛋白表达及紫杉醇诱导细胞G2/M期阻滞效应的改变等生物学特性.结果 间歇刺激法比浓度梯度递增法更容易诱导ER阴性的乳腺癌细胞获得耐药表型,231 TIM10耐药指数为11.9,231 TAX8耐药指数为2.3.用紫杉醇处理后,231 TIM10细胞能够抵抗100 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应,231 TAX8细胞仅能够抵抗10 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应.231 TIM10细胞在诱导过程中形成了两个细胞亚群,体积增大明显,细胞之间黏连更加明显.MDA-MB-231敏感细胞和两株耐药细胞均无ER-α蛋白的表达.结论 间歇刺激法更合理地模拟了临床上ER阴性乳腺癌的耐药过程,建立了可靠的细胞耐药模型,为耐药机制研究建立了基础.     

肝素结合表皮生长因子抑制剂CRM197 对裸鼠卵巢癌移植瘤 的抑制作用

目的:研究CRM197对裸鼠卵巢癌移植瘤生长的抑制作用探讨其对逆转卵巢癌组织耐药作用及其在卵巢癌治疗中的可行性.方法:用人卵巢癌亲本细胞A2780、耐紫杉醇细胞A2780/Taxol及耐顺铂细胞A2780/DDP分别建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型,观察注射CRM197组与阴性对照组裸鼠肿瘤生长情况,免疫组化法测定各组裸鼠肿瘤组织中HB-EGF及P-gp表达情况.结果:HB-EGF及P-gp在各肿瘤组织中不同程度的表达,在注射CRM197的裸鼠肿瘤组织中表达明显降低(P＜0.05),差异具有统计学意义.结论:CRM197通过抑制肝素结合表皮生长因子的信号传导通路激活抑制了裸鼠卵巢癌移植瘤的生长,使裸鼠卵巢癌移植瘤HB-EGF及P-gp表达明显降低.     

SH3GL1在紫杉醇耐药乳腺癌中的表达及临床意义

膜结合蛋白SH3GL1参与调控某些肿瘤细胞生物学行为,而其对紫杉醇耐药乳腺癌细胞的恶性生物学行为影响尚未见报道.为阐明 SH3GL1对紫杉醇耐药敏感性的影响以及潜在的分子机制,本研究首先采用免疫组化法证实SH3GL1在紫杉醇耐药乳腺癌组织高表达(P<0.001).Western印迹法证实,SH3GL1在紫杉醇耐药细胞株MCF-7/PTX高表达(P<0.01);随后,采用MTT分别检测（0,50,100 nmol/L）紫杉醇处理后MCF-7细胞株增殖情况,同时Western印迹法检测SH3GL1表达,发现100 nmol/L紫杉醇能够抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05);同时抑制SH3GL1表达(P<0.01); 敲减SH3GL1表达后,紫杉醇耐药细胞株MCF-7/PTX和MCF-7增殖速率降低(P<0.05),耐药基因MDR1表达降低(P<0.05),p-AKT和p-gp水平下降(P<0.05).上述结果表明,降低SH3GL1表达可以减弱紫杉醇耐药性,增加乳腺癌对紫杉醇的敏感性,这为临床上紫杉醇耐药乳腺癌患者的治疗提供了新的靶点.     

两株耐紫杉醇人乳腺癌细胞MCF-7的比较

建立稳定的肿瘤多药耐药(MDR)细胞株是肿瘤MDR机制研究的基础,以MCF-7细胞林为亲本细胞株,采用低浓度加量持续诱导和高浓度短期作用分别建立MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞模型,并对其耐药谱、动力学周期变化、表形变化、细胞侧群分布、药物蓄积等生物学特性比较评价.结果表明,MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞的紫杉醇(paclitaxel/Taxol)半数抑制浓度(IC50)分别是亲代MCF-7细胞的525倍和330倍,并且都对多种化疗药物交叉耐药;MCF-7/Taxola细胞S期细胞显著增加,G,期细胞减少;MCF-7/Taxolb细胞各个期变化不大;MCF-7/Taxola细胞P-糖蛋白(P-gP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和还原型谷胱甘肽-S转移酶(GSTπ)的表达水平较亲代有显著增加,而MCF-7/Taxolb细胞GSTπ的表达水平较亲代也有显著增加,另外,拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)在两株耐药细胞中表达都明显下降,而两株细胞雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性都表达丢失;光镜下耐药细胞MCF-7/Taxola明显变大并且形态不规则而MCF-7/Taxolb变化不大;电镜下MCF-7/Taxolb表面纤绒毛成小球状隆起和絮状,而MCF-7/Taxolb表面成絮状:MCF-7/Taxola撤药10天后细胞中有紫杉醇蓄积,而MCF-7/Taxolb中没有紫杉醇蓄积.两个模型都具有MDR的基本生物学特性,可用于肿瘤MDR机制的研究,通过两种耐药细胞的比较,推测MCF-7/Taxolb细胞是MCF-7/Taxola细胞的一个亚群.     

顺铂诱导三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法采用顺铂(DDP)低剂量诱导及体内外交叉致瘤结合的方法建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型;MTT法检测细胞耐药特性;实时荧光定量PCR法分析耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及GST-π表达差异;免疫组化分析耐药相关蛋白P-gp、BCRP、MMP7表达差异;蛋白印迹法检测磷酸化Akt(phosphorate-Akt,p-Akt)和总Akt(total-Akt,t-Akt)蛋白表达;小动物成像检测观察肿瘤生长情况。结果 MTT显示建立的三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型的耐药指数为12.84;耐药小鼠肿瘤组织中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA的表达量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表达量均高于非耐药小鼠(P0.01);Western blot显示,耐药小鼠肿瘤组织的p-Akt蛋白表达明显高于非耐药小鼠,t-Akt蛋白表达没有差异。非耐药小鼠与耐药小鼠肿瘤组织生长速度未见明显区别(P0.05)。分别给予这两种模型小鼠相同剂量的DDP治疗后,耐药小鼠对DDP的敏感性明显低于非耐药小鼠(P0.01)。结论初步建立了三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型,为三阴性乳腺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。     

短时间低浓度紫杉醇处理能够诱导非中心体依赖性的多极纺锤体组装和非整倍体细胞的产生

紫杉醇是一种能够与微管相结合的药物, 被广泛应用于肿瘤的治疗. 本研究发现, 应用短时间低浓度的紫杉醇处理细胞, 能诱导有丝分裂期细胞发生非中心体依赖性的多极纺锤体组装. 将细胞内的TPX2去除或在细胞内过量表达Aurora-A激酶, 能够减少紫杉醇诱导的多极纺锤体的产生. 通过缩时电影活细胞示踪观察发现, 经紫杉醇短时间处理的部分细胞可以完成多极细胞分裂, 产生多个子细胞; 其中部分子代细胞还可以再进行至少一个周期, 产生新的子细胞. 通过软琼脂板长时间培养实验显示, 紫杉醇处理后存活下来的细胞可以形成具有不同于母代细胞染色体数目的子代细胞克隆. 由以上结果可知, 短时间低浓度紫杉醇处理能诱导非整倍体子细胞的产生.     

细胞自噬与肿瘤耐药

细胞自噬是一种细胞自我降解的过程,在适应代谢应激、保持基因组完整性及维持内环境稳定方面发挥重要作用. 在肿瘤治疗中,凋亡耐受是产生肿瘤耐药的重要机制. 细胞自噬可防止抗肿瘤药诱导的凋亡,促进肿瘤耐药. 然而,自噬性细胞死亡可能是凋亡耐受肿瘤细胞的一种死亡方式. 因此,细胞自噬对肿瘤细胞的耐药性有双重影响. 本文综述了细胞自噬的分子机制、细胞自噬与凋亡的关系、细胞自噬与肿瘤耐药以及治疗的主要研究进展.     

高压氧联合化疗药物对结肠腺癌细胞 T 26 小C鼠移植瘤生长的影响

目的：探讨高压氧联合化疗药物对结肠腺癌细胞CT26小鼠移植瘤生长的影响。方法：建立小鼠结肠腺癌移植瘤模型,观察0．2MpaHBO及联合化疗药物5．FU或紫杉醇对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,计算肿瘤抑制率;用流式细胞仪观察0．2MpaHBO对CT26细胞周期的影响。结果：动物实验结果显示：HBO组小鼠肿瘤体积抑制率为：22．39％,肿瘤质量抑制率为：25．77％;5-Fu组分别为：42.38％,43．61％;5-FU＋HBO组分别为：72．10％,71．47％;紫杉醇组分别为：26．31％,23．04％;紫杉醇＋HBO分别为：33．24％。30．96％,5-FU＋HBO组与5-FU组及HB0组相比较有显著性差异（p〈0．01）;紫杉醇＋HB0组与紫杉醇组及HBO组相比差异不明显。流式细胞仪检测结果显示：0,2MpaHBO诱导CT26细胞在S期积蓄（G0／G1期（55．89％）、S期（40．79％）、G2／M期（3-32％））。结论：0．2MpaHBO可抑制了CT26结肠腺癌小鼠移植瘤的生长。并能增强细胞周期特异性化疗药物的敏感性。     

可视化紫杉醇肿瘤耐药评价细胞系的建立及应用

目的:构建稳定表达微管蛋白(GFP-α-tubulin)及组蛋白(RFP-H2B)的HeLa细胞系,用来观察肿瘤细胞有丝分裂中的染色体及微管运动,以及在紫杉醇作用下肿瘤细胞产生耐药的实时过程。方法:利用慢病毒感染的方法构建稳定标记GFP-α-tubulin及RFP-H2B的HeLa细胞系;以此为基础,利用Time-lapse显微镜实时观察该细胞有丝分裂过程中染色体及微管的运动;而后在GFP-α-tubulin/RFP-H2B/HeLa细胞系加入微管相关化疗药后,利用Time-lapse显微镜及Image J软件分析微管的光强变化。结果:构建的细胞具有正常的有丝分裂进程,定量GFP-α-tubulin的光强可用来反映微管的稳定性;在该细胞中过表达癌基因Aurora A并加入紫杉醇处理,可通过标记的微管及组蛋白的动态变化观察到细胞逃逸紫杉醇导致的细胞凋亡,最终产生多核的非整倍体耐药表型。结论:GFP-α-tubulin/RFP-H2B/HeLa细胞系不但可作为研究染色体排列及微管形态的细胞模型,对于评价紫杉醇导致的肿瘤细胞耐药也有重要的应用价值。     

热处理肿瘤细胞抗原负载树突细胞抗小鼠结肠癌效应

研究了热处理肿瘤细胞抗原负载骨髓来源的树突细胞（dendritic cell,DC）对结肠癌小鼠的治疗作用.将小鼠结肠癌细胞CT26热处理后超声破膜,以其细胞裂解液负载BALB/c小鼠骨髓来源的DC,观察DC诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）杀伤活性;并将DC接种于荷瘤小鼠皮下,观察其对肿瘤生长的抑制作用及对荷瘤小鼠生存期的影响.发现致敏DC诱导的CTL对CT26肿瘤细胞具有显著的杀伤作用.用致敏DC免疫小鼠后,对小鼠肿瘤的生长具有显著的抑制作用,并能显著延长荷瘤小鼠的生存时间.热处理肿瘤细胞抗原负载的树突细胞对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果.     

耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株的筛选

本研究通过小鼠体内实验检测我国部分地区结核分枝杆菌耐药菌株的毒力,以筛选耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株。收集从我国部分省份98例结核病患者痰培养液中分离出的结核分枝杆菌,用比例法药敏试验进行结核分枝杆菌一线和二线药物的药敏试验,筛选出对二线药物敏感而对一线药物利福平或异烟肼耐药或敏感的菌株,然后进行小鼠体内毒力实验,对异烟肼耐药相关基因katG和利福平耐药相关基因rpoB测序并进行基因突变分析。从98株菌中筛选出药物敏感谱清晰的40株,进行小鼠体内毒力实验。结果显示,共35株半数死亡时间≤H37Rv的半数死亡时间,其中18株耐利福平合并耐异烟肼、5株单耐利福平,7株单耐异烟肼、5株对利福平和异烟肼均敏感。通过小鼠毒力研究,分别筛选出基因背景清晰,半数死亡时间≤7d的耐利福平合并耐异烟肼的菌株1株、半数死亡时间≤7d单耐利福平和异烟肼的菌株各1株,作为耐药结核分枝杆菌感染小鼠模型所用菌株及进一步进行豚鼠等其他动物模型感染用候选菌株。     

瘤内注射树突状细胞联合放疗对小鼠肾癌TNF-α表达的影响

目的 研究放疗增强DC疫苗治疗小鼠肾癌的作用机理.方法 Renca肾癌细胞制作BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分别用单纯放疗、单纯DC和Dc瘤内注射联合放疗等方法治疗,第28天牺牲小鼠.体外培养2×106Renca肾癌细胞,经20 Gy X射线单次照射培养24 h后,收获细胞.提取细胞和肿瘤组织蛋白,免疫组化和免疫印迹法检测治疗后肿瘤组织中TNF-α、CD3、CD11和F4/80蛋白的表达水平.结果 DC瘤内注射联合放疗有效抑制肾癌细胞在BALB/c小鼠体内生长,局部放疗明显增加了肿瘤组织内TNF-α表达水平,体外培养的Renca肾癌细胞经放射线处理后TNF-α表达明显上调.结论 放射线能够促进肿瘤细胞分泌TNF-α,瘤内注射DC联合放疗的增效作用与肿瘤局部产生的TNF-α表达上调密切相关.     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

耐三苯氧胺乳腺癌异种移植瘤动物模型建立与评价

目的：建立耐三苯氧胺（TAM）人乳腺癌的裸鼠移植瘤模型,为研究和治疗乳腺癌对TAM耐药提供研究工具。方法：采用雌激素受体阳性,对TAM耐药的人乳腺癌细胞系LCC2,接种于BALB/c裸鼠皮下,观察肿瘤生长趋势,用免疫组化方法进行鉴定。结果：在接种细胞数大于5×106/只时,Matrigel能够显著促进移植瘤的生长。肿瘤组织病理学检测证实为浸润性导管癌,且Pgp和Her-2为阳性表达。结论：该方法建立的耐TAM人乳腺癌移植瘤模型,周期短,成瘤率高,保留了与细胞系相同的肿瘤生物学特征。     

TCR基因修饰淋巴细胞体内抗肿瘤作用的研究

建立荷人肝癌细胞BEL-7402的SCID小鼠模型,用脂质体介导进行基因转染,流式细胞术检测TCRVβ7.1基因表达,分别以尾静脉注射,肿瘤周围皮下注射以及腹腔注射三种方式给予荷瘤免疫缺陷小鼠(SCID鼠)转染TCRVβ7.1基因的人外周血淋巴细胞,24h后处死小鼠取各组织用免疫组化方法来检测淋巴细胞在小鼠体内的分布的情况.通过检测瘤重、肿瘤体积大小,并计算肿瘤抑制率,观察该基因对SCID荷瘤小鼠的抑瘤作用,为该基因用于肿瘤的临床治疗提供动物实验数据.     

耐三苯氧胺乳腺癌异种移植瘤动物模型建立与评价

目的:建立耐三苯氧胺(TAM)人乳腺癌的裸鼠移植瘤模型,为研究和治疗乳腺癌对TAM耐药提供研究工具。方法:采用雌激素受体阳性,对TAM耐药的人乳腺癌细胞系LCC2,接种于BALB/c裸鼠皮下,观察肿瘤生长趋势,用免疫组化方法进行鉴定。结果:在接种细胞数大于5×106/只时,Matrigel能够显著促进移植瘤的生长。肿瘤组织病理学检测证实为浸润性导管癌,且Pgp和Her-2为阳性表达。结论:该方法建立的耐TAM人乳腺癌移植瘤模型,周期短,成瘤率高,保留了与细胞系相同的肿瘤生物学特征。     

bcl-2核酶(Ribozyme)促进紫杉醇诱导的细胞凋亡

用核酶技术阻断或降低抗凋亡蛋白 Bcl- 2的表达以促进化疗药物紫杉醇诱导的食管癌细胞凋亡 ,探索克服耐药、提高紫杉醇疗效的新途径 .将特异性切割 Bcl- 2 m RNA的核酶克隆至含MTII启动子并可为 Zn SO4 诱导表达的真核表达载体中 ,通过脂质体转入食管癌鳞状上皮细胞系Eca 1 0 9中 ,经 G41 8筛选得到稳定抗性细胞株 X1 0 9R,挑取单细胞株扩大培养 ,1 40μmol/L Zn SO4诱导 3d,用 Northern- blot、免疫荧光、流式细胞仪鉴定核酶及 Bcl- 2蛋白表达情况 ,用 TUNEL标记及流式细胞术检测凋亡细胞的比例 .bcl- 2核酶在不同单细胞株中有不同程度的表达 ,其中一株X1 0 9R1 4表达最高 .测定其中 Bcl- 2蛋白含量 ,发现 Bcl- 2蛋白表达大为降低 .加入紫杉醇后 ,TUNEL标记及凋亡峰测定结果都表明同一条件下凋亡率升高 .结果提示 ,转入特异性切割 bcl- 2m RNA的核酶可有效地阻断 Bcl- 2蛋白合成 .Bcl- 2蛋白表达降低可明显促进紫杉醇诱导的细胞凋亡 .说明 Bcl- 2蛋白在细胞产生耐药过程中起着重要作用     

肿瘤多药耐药中的细胞色素P450

肿瘤化学治疗是目前抗肿瘤治疗最常用且最有效的方法,而在肿瘤化疗过程中出现的多药耐药现象,是导致治疗失败的主要原因.肿瘤多药耐药由多种机制共同作用而成,其中由酶类介导的多药耐药愈显重要.目前的研究发现,有多类细胞色素P450酶与肿瘤多药耐药的发生密切相关.本文着重对近年来有关细胞色素P450与肿瘤多药耐药的相关研究进行阐述,以期为肿瘤治疗提供一个新的方向.     

rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡

rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况.结果表明,rBTI(2.5μmol/L)与紫杉醇(0.05~0.5μmol/L)联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖.将rBTI与紫杉醇进行联合协同用药,诱导了MCF-7细胞凋亡及ROS的产生;同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核转位;与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和CyclinD1的表达.本研究证实,rBTI联合紫杉醇通过诱导ROS的产生,激活NFκB/p65信号转导途径,协同促进MCF-7细胞的凋亡.