蛋白激酶C在血管紧张素Ⅱ抑制心肌细胞——氧化氮合成中的作用

实验用硝酸还原酶法测定培养新生大鼠内肌细胞亚硝酸盐（ＮＯ２）和硝酸盐（ＮＯ３）总量（ＮＯ２／ＮＯ３）,反映心肌细胞一氧化氮（ＮＯ）生成情况,观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）对凡肌细胞ＮＯ生成的及其蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在该效应中的作用。结果显示：ＡｎｇⅡ可减少心肌细胞ＮＯ的含量,并具有明显的剂量－效应关系;ＡｎｇⅡ受体拮抗剂ｓａｒａｌａｓｉｎ可明显抵制ＡｎｇⅡ对ＮＯ生成的影响;Ｌ－精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）明     

蛋白激酶C在血管紧张素Ⅱ抑制心肌细胞一氧化氮合成中的作用

实验用硝酸还原酶法测定培养新生大鼠心肌细胞亚硝酸盐 (NO 2 )和硝酸盐 (NO 3)总量 (NO 2 /NO 3) ,反映心肌细胞一氧化氮 (NO)生成情况 ,观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对心肌细胞NO生成的影响及其蛋白激酶C (PKC)在该效应中的作用。结果显示 :AngⅡ可减少心肌细胞NO的含量 ,并具有明显的剂量 效应关系 ;AngⅡ受体拮抗剂saralasin可明显抑制AngⅡ对NO生成的影响 ;L 精氨酸 (L Arg)明显增加心肌细胞NO的浓度 ,此效应可被一氧化氮合酶 (NOS)抑制剂L NAME所抑制 ,L Arg未能消除AngⅡ抑制NO的作用 ;用佛波酯 (PMA)处理心肌细胞 ,其NO的生成明显减少 ,L NAME可加强此抑制效应 ;PKC抑制剂staurosporine (Stau)可明显削弱AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的效应。结果提示 :AngⅡ具有抑制心肌细胞NO生成的作用 ,此作用可能是通过抑制心肌细胞NOS的活性而实现的 ;AngⅡ受体介导AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的作用 ;激活PKC可使新生大鼠心肌细胞NO生成减少 ,NOS参与此抑制效应 ,新生大鼠心肌细胞NO生成过程的信号转导通路可能与PKC有关 ;PKC参与AngⅡ抑制心肌细胞NO的生成。     

一氧化氮在血管紧张素Ⅱ激活蛋白激酶C中的作用

实验在培养新生大鼠心肌细胞中检测NO前体L－精氨酸（L－Arg）和NO供体硝普钠（SNP）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）激活蛋白激酶C（PKC）的作用,以探讨心肌细胞PKC水平的信号转导途径,实验结果如下：（1）无血清DMEM培养心肌细胞24h后加入AngⅡ,PKC活性呈剂量依赖性增高;（2）培养基中加入L－Arg,PKC活性呈剂量依赖性降低;（3）用L－Arg100μmol/L进行预处理,30min后分别加入AngⅡ0.1μmol/L或PMA10μmol/L,PKC活性均明显降低,与单纯AngⅡ组和单纯PMA组相比均有显著性差异;用NOS抑制剂L－NAME预处理后,再加入L－Arg,可明显阻断L－Arg对上述两个效应的影响;（4）培养液中加入NO供体SNP,PKC活性呈剂量依赖性地降低;（5）用SNP10μmol／L预处理心肌细胞,5min后分别加入AngⅡ或PMA,PKC活性分别与单纯AngⅡ和单纯PMA组相比均明显降低。以上结果表明,AngⅡ能剂量依赖性激活PKC,而NO可剂量依赖性抑制PKC活性;NOS参与L－Arg抑制AngⅡ或PMA激活PKC的作用。这些观察提示,NO抑制AngⅡ对心肌细胞的作用可能是通过抑制PKC活性实现的,PKC可能是NO和AngⅡ在心肌细胞内信号转导的交汇点（cross talk）。     

培养大鼠心肌细胞缺氧与复氧时H~＋－Ca~（2＋）交换的研究

大量研究表明：心肌细胞缺氧后再复氧，可因氧反常和ｐＨ反常造成细胞内Ｃａ２＋超载。通常认为，在心肌细胞发生ｐＨ反常后，Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换加强是细胞内Ｃａ２＋超载的重要机制。本实验结果表明：阻断了Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换后，仍有部分Ｃａ２＋进入细胞，Ｃａ２＋内流量与缺氧时间成正比关系。在无Ｎａ＋溶液中也得到了同样结果，表明此时Ｃａ２＋内流是通过与Ｎａ＋无关的通路进入细胞的。进一步实验表明这种Ｃａ２＋内流与细胞膜内外ｐＨ梯度差密切相关。当胞外ｐＨ升高即胞内相对Ｈ＋浓度增加时，Ｃａ２＋内流量也增加。故推测：ｐＨ反常所致细胞内Ｃａ２＋超载的原因，除Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换外，尚有Ｈ＋－Ｃａ２＋交换机制。     

高钙摄取对易卒中自发性高血压大鼠的血压和细胞内pH，Na~＋－H~＋交换活性的

本文观察到易卒中自发性高血压大鼠接受高钙（３％）饮食６周后抑制了血压上升，胞浆游离钙浓度降低和血浆钙升高，细胞内ｐＨ也产生改变，接近正常对照的ＷＫＹ大鼠。本文对细胞内ｐＨ，Ｎａ＋－Ｈ＋交换，胞浆游离钙浓度与血压的关系进行了讨论。     

血管紧张素Ⅱ对培养心肌细胞c-fos表达和蛋白质合成的作用

本实验在培养新生大鼠心肌细胞上,探讨血管紧张素Ⅱ对心肌细胞ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ表达和蛋白质合成的影响。结果显示,血管紧张素Ⅱ能诱导ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ的表达,增加蛋白质含量,并呈量－效关系,还能加速＾３Ｈ－亮氨酸的掺入速度。上述这些作用可血管紧张素Ⅱ受体拮抗ｓａｒａｌａｓｉｎ所阻断,提示这些作用是受体介导的。     

一氧化氮在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

在培养新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮（ＮＯ）在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞以大中的作用。结果显示,血管紧张素Ⅱ可使心肌细胞蛋白质含量显著增加,心肌细胞一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性和培养液ＮＯ浓度明显降低。血管紧张素Ⅱ可明显降低心肌细胞ｅＮＯＳｍＲＮＡ水平。Ｓａｒａｌｓｉｎ和百日咳毒素（ＰＴＸ）可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的蛋白质含量增加、心肌细胞ＮＯＳ活性减弱和培养液ＮＯ浓度降低。硝普钠提高心肌细胞培养     

AngⅡ和PKC对心肌细胞AngⅡ 1型受体的转录调节

利用体外培养的心肌细胞,观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）和蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在诱导ＡｎｇⅡ１型受体（ＡＴ１）基因表达及蛋白质代谢中的作用．研究结果表明：ＡｎｇⅡ可诱导ＡＴ１ｍＲＮＡ水平一过性下调,呈时间及剂量依赖性,１０ｎｍｏｌ／ＬＡｎｇⅡ刺激细胞６ｈ,引起ＡＴ１ｍＲＮＡ水平降低幅度最大,降至对照的５１．６％±９．５％,然后逐渐回升,２４ｈ恢复至对照水平．３０μｍｏｌ／ＬＨ－７（ＰＫＣ抑制剂）能阻断ＡｎｇⅡ诱导的ＡＴ１ｍＲＮＡ水平的下调．０．３μｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＡ（ＰＫＣ激活剂）单独应用可诱导ＡＴ１ｍＲＮＡ水平下调达对照的４３％±８％,加入ＡＴ１拮抗剂ＤＭＰ８１１及Ｄｕｐ７５３均可阻断ＡｎｇⅡ诱导的ＡＴ１ｍＲＮＡ水平的下调．１０ｎｍｏｌ／Ｌ的ＡｎｇⅡ刺激心肌细胞９６ｈ可使蛋白含量降低至对照的７３．４％±５．６％,而加药持续刺激１４４ｈ可使蛋白含量较对照增加３３．８％±６．３％,Ｈ－７不能阻断ＡｎｇⅡ诱导的蛋白含量降低,但可有效地抑制蛋白含量的增加．以上结果提示：ＡｎｇⅡ对心肌细胞ＡＴ１基因的转录和细胞的蛋白代谢有调节作用,而ＰＫＣ则参与了ＡｎｇⅡ的这种调节作用     

MKP-1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用

本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(MKP 1)角度 ,研究丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标 ,以凝胶内MBP原位磷酸化测定MAPK活性 ,以免疫印迹法 (Westernboltting)分别测定MKP 1及磷酸化p44MAPK、p42MAPK蛋白表达。结果发现 :(1)AngⅡ (10 -7mol/L)处理 48h ,心肌细胞 3H 亮氨酸掺入率、蛋白含量及细胞表面积明显增加 ,AngⅡ增加 3H 亮氨酸掺入的作用可被血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1受体 )拮抗剂CV11974(10 -6mol/L)明显抑制 (抑制 85 % ) ,被MAPK激酶 (MEK)特异性抑制剂PD0 980 5 9(5× 10 -5mol/L)部分抑制 (抑制 32 5 % ) ;(2 )CV11974或PD0 980 5 9可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达及MAPK酶活性 (以γ 32 P ATP掺入表示 ) ;(3)以磷酸化MAPK蛋白表达反映MAPK活性 ,可见AngⅡ处理心肌细胞5min ,MAPK活性即开始增加 ,30min左右达到高峰 ,2h后基本恢复正常 ;而MKP 1蛋白表达 30min即见增加 ,持续 2h以上 ;(4 )用放线菌素D (actinomycinD)处理心肌细胞 30min可明显抑制MKP 1的表达 ,同时使AngⅡ致磷酸化MAPK蛋白表达时间延长至 2h以上。以上结果     

一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制

本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞,从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮（NO）信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽（ANP）的表达作为心肌肥大反应的指标,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平,以免疫印迹法测定MKP－1蛋白表达,以RT－PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现：（1）L－精氨酸（L－Arg)10,100μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16％及31％,L－Arg(100μmol/L）还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达,其作用可被NOS抑制剂L－NAME所抑制;（2）L－Arg(100μmol/L）可降低AngⅡ(0.1μmol/L）诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率,而在L－Arg处理之前用针对MKP－1的反义寡核苷酸转染心肌细胞,蛋白合成速率明显增加,可取消L－Arg的抑制作用,甚至超过AngⅡ组;（3）L－Arg(100μmol/L）明显增加MKP－1蛋白表达,比对照组增加225％,NOS抑制剂L－NAME及蛋白激酶G（PKG）抑制剂KT－5823皆可抑制L－Arg诱导的MKP－1蛋白表达,分别抑制88％、83％,而AngⅡ能增加L－Arg诱导的MKP－1的表达,较对照组增加365％,增强了L－Arg的作用。以上结果表明,NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG,促进MKP－1的表达,从而增加MAPK去磷酸化实现的。     

G蛋白,蛋白激酶C和Na^＋—H^＋交换在内皮素—1诱导培养心肌细胞肥大反应中的

内皮系-1（ET-1）是一种强的生长因子,并诱导心肌细胞肥大反应。在本实验中,我们探讨了G蛋白、蛋白激酶C（PKC）和Na＋－H＋交换在ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用。ET-1（10－10～10－7mol／L）促进3H－亮氨酸掺入,增加细胞蛋白质的含量和心肌细胞的表面积,且呈剂量依赖性,它们的EC50分别为5．2×10-10,5．2×10－10和7．3×10－10mol／L。用蛋白激酶C（PKC）抑制剂,Staurosporin（2nmol／L）预处理心肌细胞,可完全阻断ET-1诱导的心肌细胞的这些肥大反应,而蛋白激酶C激动剂,佛波酸酯（PMA）（10－8～10－6mol／L）呈剂量依赖性促进心肌细胞的肥大反应。用Na＋－H＋交换抑制剂,氨氯毗咪（10-4mol／L）预处理心肌细胞,可抑制ET－1诱导的心肌细胞肥大反应,但不影响PMA诱导的心肌细胞肥大反应。百日咳毒素（150ng／ml）预处理心肌细胞,可明显抑制ET－1诱导的心肌细胞肥大反应。这些结果提示,ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应是与百日咳毒素敏感的G蛋白相耦联,蛋白激酶C和Na＋．H＋交换可能在ET-1诱导的心肌细胞肥大反应中是重要的细胞内信使转导途径。     

G蛋白、蛋白激酶C和Na+-H+交换在内皮素-1诱导培养心肌细胞肥大反应中的作用

内皮素-1(ET-1)是一种强的生长因子,并诱导心肌细胞肥大反应.在本实验中,我们探讨了G蛋白、蛋白激酶C(PKC)和Na+-H+交换在ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用.ET-1(10-10～10-7 mol/L)促进3H-亮氨酸掺入,增加细胞蛋白质的含量和心肌细胞的表面积,且呈剂量依赖性,它们的EC50分别为5.2×10-10,5.2×10-10和7.3×10-10mol/L.用蛋白激酶C(PKC)抑制剂,Staurosporin(2 nmol/L)预处理心肌细胞,可完全阻断ET-1诱导的心肌细胞的这些肥大反应,而蛋白激酶C激动剂,佛波醇酯(PMA)(10-8～10-6mol/L)呈剂量依赖性促进心肌细胞的肥大反应.用Na+-H+交换抑制剂,氨氯吡咪(10-4mol/L)预处理心肌细胞,可抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应,但不影响PMA诱导的心肌细胞肥大反应.百日咳毒素(150ng/ml)预处理心肌细胞,可明显抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应.这些结果提示,ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应是与百日咳毒素敏感的G蛋白相耦联,蛋白激酶C和Na+-H+交换可能在ET-1诱导的心肌细胞肥大反应中是重要的细胞内信使转导途径.     

大鼠脑室内注射ANGⅡ和ANGⅡ抗体对尿钠排出和肾皮质Na~+·K~+-ATPase的影响

在麻醉大鼠的侧脑室注射16pg血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ),15min内出现尿钠增多的反应并持续90min,平均动脉血压保持稳定。肾皮质Na~+·K~+-ATPase活性(1.51±0.26μmolPi/mg Pro·h)显著低于侧脑室注射人工脑脊液的对照值(2.66±0.28μmol Pi/mg Pro·h,P<0.01),而侧脑室注射ANGⅡ抗体后5min内则出现尿钠减少的反应并持续135min。肾皮质Na~+·K~+-ATPase活性(3.61±0.34μmol Pi/mg Pro·h)显著高于对照值(P<0.05)。股静脉和脊髓蛛网膜下腔分别注射16pg ANGⅡ,均未出现尿钠增多的反应。结果表明,脑内的内源性ANGⅡ具有引起尿钠增多的作用;并提示这种作用可能与肾脏Na~+·K~+-ATPase活性的抑制有关。     

MKP—1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用

本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶－１（ＭＫＰ－１）角度,研究丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标,以凝胶内ＭＢＰ原位磷酸化测定ＭＡＰＫ活性,以免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔｔｉｎｇ）分别测定ＭＫＰ－１及磷酸化ｐ４４ＭＡＰＫ、ｐ４２ＭＡＰＫ蛋白表达。结果发     

L-型钙电流在血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大中的作用

目的:探讨血管紧张素II(Ang II)诱导的新生大鼠肥大心肌细胞中L-型钙电流的功能在分子水平改变。方法:在血管紧张素II诱导的新生大鼠肥大心肌细胞中,应用全细胞膜片钳技术检测L-型钙电流的密度及门控动力学变化;应用半定量RT-PCR技术检测L-型Ca2+通道α1C亚单位mRNA的表达量。结果:Ang II在引起新生大鼠心肌肥大的同时,也增加了心肌细胞ICa,L电流密度,但并不影响ICa,L电流的激活、失活和复活特征。另外,Ang II还增加了L-型Ca2+通道α1C亚单位mRNA表达量。Ang II的这些作用都可被其1型受体阻断剂losartan所抑制。结论:在Ang II诱导的新生大鼠肥大心肌中,L-型Ca2+通道的功能在分子水平发生了显著变化,这些变化是通过激活心肌细胞上Ang II 1型受体所介导的。     

血管紧张素Ⅱ在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

为检测血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AⅡ）对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向心肌细胞方向分化的作用,采用10-4 mol/L维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞. Western印记检测胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中表达血管紧张素Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R).诱导分化期间用1 μmol/L AⅡ刺激胚胎干细胞,计数搏动拟胚体的比例;诱导分化第14 d用real-time RT-PCR 和Western 印记检测心肌标志物的表达确定其作用. 结果显示,与对照组相比,1 μmol/L AⅡ处理组可显著增加搏动拟胚体的比例,上调心肌标志物mRNA的表达. 预先用1 μmol/L洛沙坦处理1 h后可显著阻碍这种上调作用. 本实验结果表明,AⅡ通过AT1R可促进小鼠R1胚胎干细胞向心肌细胞分化.     

质膜H~＋－ATP酶在玉米叶片渗透调节中的作用

干早胁迫下,玉米幼叶生长部位质膜Ｈ＋－ＡＴＰ酶活性显著上升,游离脯氨酸、可溶性糖和无机离子亦同时在玉米叶片生长部位大量积累,二者之间呈明显的正相关．质膜Ｈ＋－ＡＴＰ酶的专一性抑制剂Ｎａ３ＶＯ４在干旱胁迫下强烈抑制游离脯氨酸的积累,说明ＰＭＨ＋－ＡＴＰａｓｅ参与了玉米叶片的渗透调节过程．     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素-1诱导的心肌细胞原癌基因c-fos表达

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上, 探讨一氧化氮 (NO)对血管紧张素Ⅱ (AⅡ)和内皮素-1 (ET-1)诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达的影响.用Bradford 法测定心肌细胞总蛋白含量 (作为心肌细胞肥大的指标); 用基因特异性引物和 SuperScript一步法进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR), 检测大鼠心肌细胞原癌基因c-fos的表达 (以GAPDH为内标).结果显示, AⅡ和ET-1分别作用5 d和3 d后, 心肌细胞总蛋白含量显著增加; 硝普钠 (NO供体)可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞总蛋白增加.AⅡ,ET-1和PMA (蛋白激酶C激动剂)均可诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达; L-精氨酸可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达, L-NAME (NOS抑制剂)可抑制L-精氨酸的这一作用; 硝普钠对可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达.结果表明, NO可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达, 其作用机制可能与蛋白激酶C这一环节有关.     

心脏肾素－血管紧张素系统在游泳引起的生理性心肌肥大中的作用

本实验采用游泳训练（ＳＷ）引起的大鼠心肌肥大模型,通过放射免疫及生化等方法,对生理性心肌肥大时,心脏和循环肾素－血管紧张素系统（ＲＡＳ）的变化进行了初步研究。观察到游泳五周时,大鼠左、右心室重与体重比值（Ｖ／Ｂｗｔ）显著升高,同时,左、右室心肌血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）含量及心肌Ａｎｇ转换酶（ＡＣＥ）活性也较对照组明显升高（Ｐ＜０．０５）。心肌ＡｎｇⅡ与Ｖ／Ｂｗｔ之间存在明显的正相关关系（ｒ＝０．７７２１,Ｐ＜０．００１）。ＳＷ组血浆ＡｎｇⅠ,Ⅱ及肾素活性（ＲＡ）与对照组相比无明显差异,其血浆ＡｎｇⅡ与Ｖ／Ｂｗｔ之间无明显相关性。上述研究提示：心脏ＲＡＳ在ＳＷ引起的生理性心肌肥大中可能起着重要作用,而且这种作用在很大程度上不依赖于循环ＲＡＳ。     

两价阳离子在类囊体膜上H~＋－ATP酶活化中的作用

在高盐介质中用ＥＤＴＡ去除叶绿体内源游离Ｍｇ２＋后制备的类囊体具有与正常类囊体相似的△ｐＨ幅度和光合磷酸化反应速率,即膜上ＣＦ０与ＣＦ１仍处于正常的耦联状态。以此为材料研究不同两价阳离子（Ｍ２＋）在ＡＴＰ酶活化及催化反应中的作用,结果表明：（１）Ｍｇ２＋Ｃａ２＋Ｍ２＋Ｚｎ２＋Ｃｏ２＋Ｂａ２＋分别对光下ＡＴｈ形成与水解的效应大小与它们的离子半径有一定关系。（２）这些Ｍ２＋以不同方式不同程度地抑制了Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的合成或水解ＡＴＰ的活性。（３）低浓度Ｍ２＋的电荷屏蔽效应可稳定酶在光下的活化构象,这有利于暗中进行的需Ｍｇ２＋的催化ＡＴＰ合成与水解反应。