猪源大肠杆菌耐药质粒图谱及耐药性分析

目的:探讨猪大肠杆菌的耐药质粒图谱、耐药性及耐药基因之间的关系。方法:从湖南省株洲、益阳的四个猪场分离出9株大肠杆菌,进行质粒电泳图谱分析、用PCR法检测耐喹诺酮类耐药基因Gyr A、Par C和耐四环素类耐药基因Tet A、Tet B,并采用Kirby-bauer法对这9株大肠杆菌进行药敏(18种抗生素)试验。结果:其中9株大肠杆菌含有三条或者三条以上的质粒条带,且其质粒谱型均不相同;9株大肠杆菌均检测出4种耐药基因Gyr A、Par C、Tet A和Tet B;9株大肠杆菌对所选用的抗生素存在不同程度的耐药性,其中7株大肠杆菌对10种或10种以上的抗生素耐药,最高对13种抗生素耐药,氨苄西林、青霉素、阿莫西林、红霉素的耐药率达100%,对四环素、多西环素的耐药率达到88.9%,而多粘菌素B、阿奇霉素、大观霉素耐药率较低。结论:耐药性与质粒条带数、耐药基因之间并无明显的相关性;猪大肠杆菌呈多重耐药之势,在治疗大肠杆菌病时最好根据药敏实验结果选用合适的抗生素。     

大熊猫粪源大肠杆菌耐药性及整合子研究

为了解大熊猫粪源大肠杆菌的耐药性、整合子-基因盒的分布特性,分析整合子对细菌耐药性的影响,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行了50株大肠杆菌对13种抗菌药物的药物敏感性试验;PCR-测序法检测了1、2、3型整合酶基因,进一步对阳性菌株可变区的基因盒序列鉴定分析。结果显示,菌株对13种抗菌药物表现出不同的耐药性,其中对氨苄西林、头孢唑林、四环素和复方新诺明表现出较高耐药性(耐药率为30%~68%),对其余药物耐药性较低(耐药率低于14%);50株菌中有15株(30%)含有1型整合子,未发现2型和3型整合子;15株1型整合子阳性菌中,有6株(40%)扩增出1200~2000 bp的基因盒,主要介导氨基糖苷类和磺胺-甲氧苄啶耐药的aad A和dfr A基因家族。以dfr A27+aad A2为主(检出率83.33%),1株为aac A4+aad A1+cat B2。以上说明本次检测的大熊猫粪源大肠杆菌对多种抗菌药物呈低水平耐药;1型整合子在大肠杆菌中广泛分布,整合子-基因盒是造成整合子阳性菌株耐氨基糖苷类、磺胺-甲氧苄啶类、氯霉素的主要原因。     

健康猪直肠粪便中沙门菌I类整合子与耐药基因的检测

目的了解安徽省规模化猪场健康猪直肠粪便中沙门菌分离株多重耐药情况及其与I类整合子和耐药基因的携带关系。方法采用标准K-B纸片法对22株沙门菌分离株进行15种抗生素敏感试验;应用PCR技术对沙门菌分离株进行I类整合子及耐药基因检测。结果 22株沙门菌分离株中有20株(90.91%)对2种以上抗生素耐药,属于多重耐药株,羧氨苄青霉素-四环素-卡那霉素-氯霉素-氟苯尼考是主要多重耐药谱;22株沙门菌中有19株(86.4%)携带I类整合子,tetB、aph(3)-IIa和cmlA基因分别检出最高。结论沙门菌多重耐药性与整合子携带之间的关系密切,耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致,基因组DNA携带的耐药基因种类多于质粒。     

54株猪源肠外致病性大肠杆菌血清型、系统进化群和基因型

摘 要:[背景]近年来,我国规模猪场着重加强了对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪瘟、猪伪狂犬病、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病等疫病的防控,却忽视了由肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)对猪群健康产生的潜在危害性,了解和掌握猪源ExPEC流行特征意义显著。[目的]探究临床分离的54株猪源ExPEC血清型、系统进化群和基因型的分布及流行特征。[方法]应用玻板凝集试验和试管凝集试验鉴定O抗原血清型,采用PCR技术检测系统进化群鉴定相关基因、28个ExPEC相关毒力基因以及多位点序列分型相关基因。[结果]受试菌中有52株确定了O抗原血清型,其中40株为O38 (74.1%),为优势血清型;8株为O127 (14.8%),O93和O11均2株(各占3.7%)。受试菌中44株为B2群(81.5%),是主要系统进化群,D群和B1群均5 株(各占 9.3%);28 个 ExPEC 相关毒力基因中ompA、ibeA、fimH、traT、focD、papA、iroN、iutA、iucD、cvaC、tsh、kpsMT Ⅱ、iss和ompT出现的频率超过50%,其中ompA和ibeA检出率分别达100%和96.3%,为高度流行的毒力基因,未检到cnf1,而bmaE、malX和iha更倾向分布于D群菌株中。受试菌共呈现31种ST型,其中ST10和ST648均5株(各占9.3%),ST410和ST101均4株(各占7.4%)。[结论]猪源ExPEC优势血清型及系统进化群在不同地区、不同时段上的流行分布均存在一定差异,呈现动态过程,O38作为优势血清型目前尚未见报道,具有高致病性的B2群和D群菌株有逐渐增多的趋势。ST型复杂多样,呈现遗传多样性,在一定程度上与人源和禽源ExPEC具有相同的遗传背景。     

林麝肺源致病性大肠杆菌O因子血清型鉴定及部分耐药基因的PCR检测

为调查林麝肺源致病性大肠杆菌O因子血清型以及相关耐药基因的流行状况,本试验采用玻板凝集反应法进行O因子血清型鉴定;同时用PCR方法检测耐药基因。结果显示:O血清型定型的有16株菌,分别属于9个不同的血清型,其中O78为优势血清型,占定型菌株的43.75%(7/16)。同时,29株菌皆携带多种耐药基因,其中磺胺类耐药基因sul1、sul2、sul3,喹诺酮类耐药基因aac(6')-Ib、qnrB,β-内酰胺酶类耐药基因blaTEM、blaCTX-M,氨基糖苷类耐药基因aac(3)-IIa、ant(3″)-Ia和四环素类耐药基因tet(B)检出率较高,检出率分别为100%、96.55%、96.55%、100%、86.21%、100%、65.52%、100%、96.55%和58.62%。本试验结果对林麝临床科学合理用药有重要指导意义。     

零售食品中耐药性和肠外致病性大肠埃希菌的检测

美国有数百万泌尿道感染（UTI）是由大肠埃希菌（简称大肠杆菌）所致的肠外感染。由于肠外致病性大肠杆菌株（ExPEC）的耐药，其治疗变得更加困难，这种特殊的大肠杆菌还可产生导致肠外感染的特殊毒力因子（VF）。     

肠外致病性大肠杆菌致病机制及公共卫生学意义

致病性大肠杆菌包括肠致病性大肠杆菌(intestinal pathogenic Escherichia coli, IPEC)和肠外致病性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicE.coli,ExPEC),可引起人和动物多种感染性疾病。ExPEC主要在肠道外其他组织脏器定殖并导致感染,包括尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicE.coli, UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(newborn meningitis E. coli, NMEC)和禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E. coli, APEC)。人源ExPEC (UPEC和NMEC)主要引起人尿道感染、肾盂肾炎和新生儿脑膜炎,而APEC可导致禽类的大肠杆菌病,造成家禽业的巨大经济损失。另外,乳腺致病性大肠杆菌(mammary pathogenic E. coli, MPEC)和猪源ExPEC可导致奶牛乳房炎、猪的肺炎及急性败血症等病症。研究发现,ExPEC类菌株在基因组结构上很相似,与IPEC本质区别在于致病机制不同,ExPEC具有很多相同的毒力基因和耐药基因,而且动物源ExPEC...     

猪源肠外致病性大肠埃希氏菌的生物膜形成能力及耐药性

[背景]猪源肠外致病性大肠埃希氏菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEc)是一种严重危害养猪业的病原菌,有关其生物膜形成能力与耐药性的研究报道很少。[目的]探讨从病猪肺脏中分离鉴定的3株ExPEc的生物膜形成能力及耐药性,为从抗生物膜形成角度防治猪肠外大肠埃希氏菌病提供参考。[方法]采用96孔板结晶紫染色法结合正交实验优化猪源ExPEc分离株的生物膜形成最佳条件与成膜能力;通过扫描电镜观察各菌株生物膜的形态结构;利用PCR方法检测其携带的生物膜形成相关基因;采用微量肉汤稀释法测定抗生素对生物膜态与浮游态下猪源ExPEc分离株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。[结果]3株猪源ExPEc的最佳成膜条件并不一致,但在各自最佳条件下均能形成很强的生物被膜且同时携带10个生物膜形成相关基因(pgaA,pgaB,pgaC,pgaD,luxS,fimA,hipA,iha,flhC,flhD)。扫描电镜观察显示,菌株SE-1聚集后可形成片状生物膜,菌株SE-2和SE-3聚集后可形成多...     

多重耐药铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子-基因盒的检测与分析

目的检测多重耐药铜绿假单胞菌(multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa,MDRPA)携带Ⅰ类整合子-基因盒,分析其与耐药表型的相关性。方法使用K-B纸片扩散法(简称K-B法)进行药敏试验,确定菌株耐药表型;用PCR扩增Ⅰ类整合酶基因及可变区的基因盒,并进行测序及序列分析。结果 23株MDRPA中19株检出Ⅰ类整合酶基因,其中15株携带基因盒,基因盒结构共有6种。其中6株携带aad A4a、3株携带aac A4-cat B8-aad A1、1株携带aac(6’)lai-orfv-aad A1-qac EΔ1-sul、3株携带blaIMP-6-qnr-aac A4-blaOXA-1-aad A1-qac E△1-sul、1株携带permease of ABC transporter gene、1株携带bacteriophage protein gene。在15株携带Ⅰ类整合酶基因盒的可变区中,检出8种耐药基因和2种新型基因盒。结论 MDRPA携带的Ⅰ类整合子-基因盒结构具有多样性,与菌株的多重耐药表型密切相关;检出两种新型基因盒,分别是ABC转运系统蛋白和噬菌体蛋白的编码基因。这两种新型基因盒的功能尚不清楚,特别是它们与菌株耐药性的关系,有待进一步研究。     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

Antibiotic resistance patterns and sequencing of class I integron from uropathogenic Escherichia coli in Lebanon

Aim: To study the prevalence and molecular basis of antimicrobial resistance in UPEC. Methods and Results: PCR was used to detect the presence of the Class I integron variable region (VR). The VR amplicons were then characterized by partial sequencing and restriction digestion with AluI. VR negative isolates showed more antibiotic susceptibility than VR positive isolates. 30% of the isolates were positive for the VR and carried the genes dfrA7, dfrA17‐aadA5, dfrA1‐aadA1, dfrA12‐orf5‐aadA2 and bla_OXA‐30‐aadA1. Five restriction patterns were detected and isolates with the same VR amplicon size had the same restriction pattern. Conclusions: Our data demonstrated that Class I integrons are widely disseminated in Lebanon and showed their importance for the occurrence and transmission of multidrug resistance. Significance and Impact of the Study: These findings will facilitate greater understanding of the factors that contribute to the presence and transfer of integron‐associated antibiotic resistance genes in UPEC.     

金属离子抑制细菌整合子捕获耐药基因盒的机制研究

【目的】探索金属离子对整合子捕获耐药基因盒的影响及其相关机制。【方法】在大肠埃希菌中构建一个1类整合子捕获耐药基因盒的体内模型。通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)测定不同浓度银(0.3、0.9、1.5μg/mL的Ag+)和铜离子(5、50、100、150、210μg/mL的Cu²⁺)干预后实验组和无金属离子干预对照组整合子整合频率,并用表型筛选法验证。利用质谱法测量细菌吸收的金属离子浓度,并进一步通过转录组测序方法分析银离子抑制细菌整合子捕获耐药基因盒的分子机制。【结果】qPCR和表型筛选法的结果表明,0.9μg/mL银离子组整合频率为9.42×10^-5(6.49×10^-5,1.44×10^-4),1.5μg/mL银离子组整合频率为7.29×10^-5(4.45×10^-5,9.03×10^-5),与对照组2.59×10^-4(2.24×10^-4,3.33×10^-4)相比整合频率明显降低,差异有统计学意义(P<0.001)。而不同浓度铜离子组与对照组没有明显差异。转录组测序方法对银离子作用前后大肠杆菌基因表达水平进行对比分析,通过GO功能和KEGG通路富集发现,差异表达基因与甲基半乳糖苷转运(methylgalactoside transport)、麦芽糖转运(maltose transport)、磷酸烯醇式丙酮酸-甘油磷酸转移酶活性(phosphoenolpyruvate-glycerone phosphotransferase activity)和甘油激酶活性(glycerone kinase activity)等功能有关以及涉及氨基酸糖和核苷酸糖代谢(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、鞭毛组装(flagellar assembly)、阳离子抗菌肽(CAMP)耐药性[cationicantimicrobial peptide(CAMP)resistance]、果糖和甘露糖代谢和磷酸糖转移酶系统[phosphotransferase system(PTS)]等代谢通路。通过蛋白互作网络筛选出前12个枢纽基因(ptsG、malE、lamB、lacZ、malK、basR、ais、ugd、nagE、metN、malQ和malF)。【结论】一定浓度银离子可以抑制整合子整合耐药基因盒。铜离子对整合频率影响不明显,因此不是所有具有杀菌性的金属离子都能对整合频率产生影响。银离子抑制细菌整合子捕获耐药基因盒可能是通过影响麦芽糖转运和碳分解代谢来调控。然而,碳分解代谢和麦芽糖转运过程很复杂,需要进一步研究。目前尚无细菌整合子转录组学相关研究,这为解决细菌耐药性问题提供了一个新的途径。     

Identification and characterization of class 1 integron resistance gene cassettes among Salmonella strains isolated from healthy humans in China

Twenty-three strains of Salmonella spp. isolated from healthy humans in Guangdong, China, were examined for their susceptibility to ten common antibiotics and the presence of antibiotic resistance integrons. All the strains were resistant to at least one antibiotic, and 4 strains were positive for the intI1 gene. Polymerase chain reaction using in-F and in-B primers showed the existence of amplicons of 1,009 bp in two, 1,664 bp in one, and 1,009 bp and 1,664 bp in one of the intI1 -positive isolates, respectively. Sequence analysis revealed that the 1,009-bp amplicon harbored gene cassette aadA2, conferring resistance to spectinomycin, and the 1,664-bp amplicon harbored genes aadA5 and dfr17, conferring resistance to spectinomycin, streptomycin and trimethoprim. Meanwhile the experiments of plasmid conjugation and Southern hybridization with intI1 as the DNA probe indicated that all the integrons found in these strains were chromosomal. Because the strains carrying class 1 integrons were isolated from healthy humans, it suggests the need for all-round surveillance of the antibiotic resistance of pathogens.     

山东省某地区奶牛源大肠埃希菌的血清型、耐药特性及分子特性

【目的】旨在对从山东省某地区4个健康奶牛养殖场分离到的大肠埃希菌进行优势血清型、耐药特性、Ⅰ类整合子基因盒携带情况以及系统进化群分析。【方法】采集194份来自山东省某地区4个规模化奶牛场奶牛新鲜粪便样品,进行大肠埃希菌分离和鉴定,利用常用大肠埃希菌诊断血清进行血清型鉴定;利用10%的绵羊血平板检测溶血性;利用K-B法检测对14种常规抗菌药物的敏感性;利用聚合酶链式反应(PCR)检测革兰阴性菌常见的6大类24种耐药基因、Ⅰ类整合子基因盒结构并对目的条带测序分析;利用细菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术分析大肠埃希菌的ST型并使用eBURST v3软件分析菌株之间的克隆关系。【结果】从194份新鲜粪便样品中分离到171株大肠埃希菌,其中主要为致病性(19.9%)和侵袭性大肠埃希菌(17.0%),优势血清型分别为O128:K67(12/171)和O143:K7(12/171)。另外,具有溶血性的大肠埃希菌阳性率为9.4%(16/171);药敏试验结果显示多重耐药菌株的比率为22.2%,其中对氨苄西林耐药率最高为33.9%,四环素次之,为24.0%;PCR检测耐药基因和整合子结果显示,59.1%的菌株携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM,59.1%的菌株携带氨基糖苷类耐药基因ant(2′),未检测到四环素耐药基因tetA和tetB;Ⅰ类整合子的阳性率为4.1%(7/171),dfrA12-aadA2-sul1为优势基因盒结构(4/171);MLST将大肠埃希菌分为8种ST型,其中,ST155(10/171)和ST58(45/171)形成一个克隆复合物且没有发现新的ST型。【结论】本研究证实,从该地区规模化健康奶牛场新鲜粪便中分离到的大肠埃希菌优势血清型为O128:K67和O143:K7;少部分大肠埃希菌具有溶血性;仅对氨苄西林、四环素等具有较高的耐药率;优势基因盒结构为dfrA12-aadA2-sul1;MLST分型显示不同奶牛场分离出亲缘关系较近的菌株,其分布具有多态性,血清型与ST型之间无相关性。本研究表明源自表观健康的奶牛的大肠埃希菌存在多重耐药现象,具有食品公共卫生安全隐患,该研究对于提升规模化奶牛场奶制品的安全生产与质量评估具有一定的理论指导意义。     

环境中抗生素抗性基因与I型整合子的研究进展

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)作为一种新型污染物在不同环境中广泛分布、来源复杂,对生态环境和人类健康造成了很大的潜在风险。同时,Ⅰ型整合子(Int Ⅰ)介导的ARGs水平转移是环境中微生物产生耐药性的重要途径,Ⅰ型整合子整合酶基因(intI1)与ARGs丰度在环境中表现出了较高的正相关性,Int Ⅰ可以作为标记物在一定程度上反映ARGs在环境中的迁移转化规律和人类活动影响程度。本文介绍ARGs与Int Ⅰ在环境中的来源与分布,总结Int Ⅰ介导的ARGs迁移转化机制以及相关研究方法,并展望未来的研究发展趋势。     

通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌耐药性检测及一株多重耐药菌全基因组测序分析

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)是引起犊牛腹泻的最主要病原菌,其耐药性菌株的不断出现引起广泛关注。【目的】了解内蒙古自治区通辽市犊牛腹泻大肠杆菌耐药性及耐药基因流行情况。【方法】从通辽市多个旗县采集犊牛腹泻样品40份,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,最终鉴定出20株大肠杆菌。采用药敏试验和PCR方法对分离菌进行耐药性及耐药基因检测分析,并对其中1株多重耐药菌株进行全基因组测序。【结果】20株分离菌均具有多重耐药性,对链霉素、环丙沙星、恩诺沙星和复方新诺明的耐药率达80%以上。所检耐药基因中,aphA1、strB、TEM-1和qnrS检出率达100%。通过对代表性菌株TL-13全基因组测序发现,其基因组大小为4897185bp,GC含量为50.68%,同时携带2个质粒,大小分别为108288bp(pTL13-1)和64018bp(pTL13-2)。质粒中共携带18个可移动耐药基因。【结论】通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药性普遍存在,4种常见耐药基因普遍流行。     

Detection of Pseudomonas aeruginosa carried a new array of gene cassettes within class 1 integron isolated from a teaching hospital in Nanjing, China

We report here novel array of gene cassettes found in single variable region of class 1 integron disseminated in Pseudomonas aeruginosa isolated from a teaching hospital in Nanjing, Jiangsu Province, China. 29 of 47 (61%) P. aeruginosa strains were confirmed haboured class 1 integron, and all the positive strains have the same variable region confirmed by PCR and RFLP methods. The variable region contained an unreported order of four gene cassettes aac(6′)-II-aadA13-cmlA8-oxa-10. Of those, cmlA8 gene was a variant of cmlA5 encoding non-enzymatic protein which putatively confer resistance to chloramphenicol. Susceptibility testing revealed multidrug-resistant mechanisms were involved in the class 1 integron positive clinical isolates. And the class 1 integron located on an about 15 kb transferable plasmid was certified by conjugation experiment and plasmid DNA analysis. The macro restriction profile indicated those clinical strains were clonally related. These authors contributed equally to this work.     

狐、貉源大肠杆菌分离鉴定及毒力基因检测

[背景]狐、貉肺炎频发导致养殖户遭受巨大经济损失.[目的]调查黑龙江省、吉林省、河北省、山东省等地狐、貉肺炎原因,对病原菌进行分离、鉴定及部分生物学特性研究.[方法]无菌采集患病狐、貉肺组织进行细菌分离培养;对分离菌进行革兰氏染色、生化试验、特异性基因PCR鉴定、药物纸片扩散法敏感性试验、毒力基因检测及小鼠致病性试验....     

产超广谱β-内酰胺酶细菌中I类整合子的研究进展

产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum beta-lactamase, ESBLs)细菌的多重耐药性是临床用药的一大难题, 近年研究发现其耐药性的产生与整合子密切相关, 其中临床最常见、研究最深入的是I类整合子。整合子是一种可移动基因元件, 在整合酶的作用下捕捉外源基因盒并使之表达, 是具有基因整合和切除功能的天然克隆和表达系统。研究表明I类整合子可连续捕捉和整合多种耐药基因, 以质粒或转座子为载体在细菌之间传播耐药性, 使ESBLs细菌多重耐药趋势十分严峻。本文就I类整合子的结构特征、I类整合子对耐药基因盒的整合作用及其与ESBLs细菌耐药性的关系等方面进行综述。     

上呼吸道分离鲍曼不动杆菌1 型整合子的分离与鉴定

【目的】研究I型整合子的结构特征,探讨其与细菌多重耐药之间的相关性。【方法】收集2008年至2009年广州呼吸疾病研究所上呼吸道分离的187株鲍曼不动杆菌,应用K-B纸片扩散法检测耐药性,采用聚合酶链式反应进行I型整合子整合酶基因的检测;扩增整合子的可变区,应用DNA测序技术分析I型整合子基因结构。【结果】I型整合子的阳性率达53.4%。共七种1型整合子基因盒被鉴定,其中首次发现报道一种新的整合子(GenBank:HQ322622)。可变区主要编码氨基糖苷类药物的耐药基因。20种抗菌素耐药的结果均表明携带Ⅰ型整合子的鲍曼不动杆菌耐药率较不携带I型整合子的鲍曼不动杆菌的耐药率明显增高。整合子与鲍曼不动杆菌的多重耐药表型具有密切相关性。【结论】I类整合子相关耐药基因在本院临床分离鲍曼不动杆菌中分布较广泛。整合子在鲍曼不动杆菌耐药性的形成和播散中具有重要作用。