墨西哥仙人掌植物内生真菌的研究Ⅰ.内生真菌分离及其抗菌活性筛选

从一种墨西哥仙人掌[Opuntiamicrodasys(Lehm .)Pfeiff]的肉质茎中分离获得31株内生真菌,经形态观察分类鉴定为3个目、3个科、14个属。同时选择2 2种病原微生物作为指示菌进行抑菌试验,研究其抗菌活性。结果表明:3株仙人掌内生真菌分别对细菌、植物病原真菌和皮肤致病真菌多种病原微生物有较为明显的抑制生长作用。     

红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选

本文对厦门集美红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kan-delia candel)的多个部位进行内生真菌的分离和形态鉴定,并采用菌饼法对分离到的内生真菌进行抗菌活性筛选。结果显示,从3种红树植物的根、茎、叶中分离得到25株内生真菌,分别隶属8个类群,以链格孢属和曲霉属为主,分别占菌株总数的28.0%和24.0%;有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用,占菌株总数的76.0%。研究结果表明,红树植物来源的内生真菌数量多,种属丰富,同时具有良好的抗菌活性,是研究抗菌活性化合物的重要资源。     

虎杖内生真菌的分离及产抗菌活性物质的筛选

从植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)的根状茎中分离出24株内生真菌,分别对其液体发酵液进行抗菌活性检测,结果筛选出3株内生真菌具有抗菌活性,它们分别属于曲霉属、青霉属和无孢菌类。     

白花泡桐内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选

从白花泡桐根、茎、叶中分离出19株内生真菌,对分离出的真菌分别利用琼脂块法和纸片扩散法进行初选和复选,通过形态学特征观察和rRNA基因ITS序列系统发育分析对抗菌活性菌株进行鉴定。抑菌试验结果显示JSD-8、JM-1和JM-10等3株内生真菌对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.769、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC1.1103和白色念珠菌(Candida albi-cans)ATCC10123均有一定的抗菌活性。鉴定结果表明,JSD-8、JM-1、JM-10分别属于串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)、长柄链格孢菌(Alternaria longipes)和托姆青霉菌(Penicilium thomii)。     

濒危植物七子花内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选

首先从濒危植物七子花中分离到38株内生真菌,综合运用形态特征和分子生物学技术,明确其分类地位。38株植物内生真菌分属于6个属和1个无孢子群,其中交链孢属和刺盘孢属为优势菌群,葡萄座腔菌属、镰刀菌属、赤霉菌属、拟茎点霉属和无孢子群为常见属。以大肠埃希菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌为靶标菌对获得菌株发酵液粗提物进行抑菌试验,发现95%以上的菌株对试测细菌具有一定的抗菌活性,表明七子花内生真菌的抗菌活性十分普遍;其中QZHⅡ10对大肠埃希菌具有较好的抑菌活性,抑菌圈直径为12.0 mm;而QZHⅡ07则对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强,抑菌圈达到15.5 mm。这表明七子花内生真菌具有开发为微生物源杀菌剂的价值。     

白苞蒿内生真菌的分离及其抗肿瘤抗菌活性筛选

重视药用植物内生真菌的研究,实现利用内生真菌代替药用植物生产活性物质,具有重要的生态学和经济学意义。白苞蒿(Artemisia lactifloraWall.ex DC.)是一种重要的药用植物,已收载于《中国药典》2010年版一部附录,是中药刘寄奴的基原植物之一,具有清热、解毒、止咳、消炎、活血、散瘀、通经等功效,用于肝、肾疾病的治疗。该研究以白苞蒿的根、茎、叶和花为试验材料进行内生真菌的分离,共分离得到白苞蒿内生真菌54株;以人骨髓白血病细胞系(HL-60)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)和人前列腺癌细胞系(PC-3)为细胞模型,采用MTT法对54株白苞蒿内生真菌发酵物粗提物的体外抗肿瘤活性进行筛选,发现对3种肿瘤细胞增殖的抑制率在90%以上的菌株共有5株,占总菌株数的9.3%;以白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌3种病原细菌为靶标菌,采用滤纸片法对54株白苞蒿内生真菌发酵物粗提物的抗菌活性进行筛选。结果表明:所有菌株对白色念珠菌均未表现明显的抑菌活性,而对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有一定抑菌活性的菌株共有17株,占总菌株数的31.5%,其中有2株对金黄色葡萄球菌表现较强的抑菌活性。     

木本曼陀罗内生真菌抗菌活性的筛选研究

从木本曼陀罗植物内生真菌中筛选高效抗菌活性的菌株。选择与人类和植物相关的36株病原微生物,分别对分离自木本曼陀罗(Datura arborea L.)植物的内生真菌77株进行了发酵代谢产物的抗菌活性筛选研究。结果显示:对细菌病原菌、皮肤致病真菌、植物致病真菌有抑制作用的内生真菌分别有24,9,17株,其中5株内生真菌对10种以上的供试病原菌有明显的抑制作用,活性最好的1株对20种病原菌有较强抑制活性,最大抑菌圈直径达48mm。这说明木本曼陀罗植物内生真菌抗菌能力较强,抗菌谱较广。     

杜仲内生真菌的抑菌活性筛选

以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为测试菌种。对杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)根、茎、叶中分离出的20株内生真菌及其次生代谢物进行抗菌活性筛选。结果表明：有15个菌株至少对1种实验细菌具有抑菌活性,19株的代谢产物至少对1种实验细菌具有抑菌活性,其中有3株内生真菌及其次生代谢产物对测试病原细菌均有较强抑制作用。     

远志内生真菌分离鉴定及活性筛选

从两个不同生长时期野生远志中分离内生真菌菌株88株,隶属于28个属,研究了各菌株对3种指示菌的拮抗作用。结果表明,远志不同生长时期不同部位的内生真菌数量、分布、种群存在差异,其优势属为Alternaria Nees。茎中内生真菌种类较多。88株内生真菌中有73株菌至少能拮抗1种指示菌,占总菌数的83.0%。4株抗性较强的菌株分别隶属于Trichothecium Link、Cephalosporium Corda、Alternaria Nees、Dactuliophora C.L.等。     

远志内生真菌分离鉴定及活性筛选

从两个不同生长时期野生远志中分离内生真菌菌株88株,隶属于28个属,研究了各菌株对3种指示菌的拮抗作用。结果表明,远志不同生长时期不同部位的内生真菌数量、分布、种群存在差异,其优势属为Alternaria Nees。茎中内生真菌种类较多。88株内生真菌中有73株菌至少能拮抗1种指示菌,占总菌数的83.0%。4株抗性较强的菌株分别隶属于Trichothecium Link、Cephalosporium Corda、Alternaria Nees、Dactuliophora C.L.等。     

重楼中一株产纤维素酶内生真菌的分离及鉴定

从重楼根茎中分离、鉴定具有产纤维素酶活性的内生真菌。采用表面消毒法从重楼块茎中分离内生真菌;用纤维素酶活性CMC平板检测分离菌株的产纤维素酶活性;对高产菌株进行形态学观察和分子生物学测序鉴定;探究影响纤维素酶活力的因素;利用平板法检测该株菌产其他胞外水解酶的活性。从3个来源的重楼中分离出41株内生真菌,通过平板检测发现AS-5、AS-7、AS-9和AS-18菌株能产生纤维素酶,其中AS-9菌株活性最强;通过形态学观察和ITS、LSU序列分析将AS-9菌株鉴定为Setophoma terrestris;该菌在pH值为7.0和温度为28℃时表现出最大纤维素酶活性,紫外线照射对产纤维素酶活性无明显作用;检测发现AS-9菌株同时具有产酪蛋白酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶和脲酶活性。首次在重楼中发现内生真菌Setophoma terrestris,且具有较好的产纤维素酶能力,值得深入研究。     

接种不同AM真菌对滇重楼幼苗功能基因表达的影响

为探究接种不同外源性从枝菌根(Arbuscular mycorrhizae,AM)真菌对滇重楼幼苗基因表达的影响,本研究以灭菌土壤为生长基质,将滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)新鲜种子与28种AM真菌于室温盆栽条件下共培养,采用实时荧光定量PCR的方法检测鲨烯环氧酶基因(Squalene epoxidase,SE)、共生受体类似激酶基因(Symbiosis-receptor-like kinase,SYMRK)、产生钙离子振荡的通道蛋白基因(Doesn’t making fections 1,DMI1)、钙/钙调依赖性蛋白激酶基因(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase,CCa MK)4个功能基因在滇重楼幼苗的差异表达情况。结果表明:28株AM菌株可不同程度的影响SE、SYMRK、DMI1、CCa MK 4个功能基因的表达,其中薄壁两性囊霉(Ambisporaleptoticha,Ale)和崔氏原囊霉(Archaeospora trappei,Atr)可以显著增加4个功能基因的表达量。隐类球囊霉(Paraglo-mus occultum,Po)和透明盾巨孢囊霉(Scutellospora pellucida,Spe)可以增加SE、SYMRK的表达,细凹无梗囊霉(Acau-lospora scrobiculata,Asc),亮色盾巨孢囊霉(Racocetra fulgida,Rfu),哥伦比亚内养囊霉(Entrophospora colombiana,Ec),明球囊霉(Rhizophagus clarus,Rcl),根内球囊霉(Rhizophagus intraradices,Rin)可以增加DMI1的表达。综上所述,接种的28株AM真菌菌株中Ale和Atr能显著的提高4种功能基因的表达,结合前期与滇重楼无菌播种幼苗进行共生培养分析AM真菌对种子萌发及幼苗化学成分的影响,推测这两株菌可望能作为培育滇重楼菌根化苗的理想菌株,人工接种AM真菌可为保护和提高滇重楼开辟了一条新的途径。     

滇重楼可持续采收方法初探

滇重楼是云南传统的道地药材。由于种苗繁育困难和生长周期长,重楼的推广种植多年来未能取得突破。滇重楼的"多年栽培,分期采收"技术是将滇重楼根茎按用途分为药用部分与种苗部分,采收时,仅采收药用部分,种苗部分(带顶芽的根茎)继续生长发育,而不是将整个根茎全部采收作为商品药材。通过考察滇重楼须根比率的月度变化规律及3年的根茎生长量,进行采收时间和经济效益分析。结果表明:实施滇重楼"多年栽培,分期采收"技术间隔时间以3年为宜,每年每公顷收益为11.25万～33.0万元,采收时间以12月至翌年3月份为宜。     

滇重楼植物的研究进展

滇重楼作为我国西南地区的道地药材,具有抗肿瘤、止血、免疫调节和镇静镇痛等药用价值。然而,对滇重楼的系统位置,分类学者各持不同意见,而且多年来人们对滇重楼过度地采挖,使各地野生资源遭到不同程度的破坏。本文综述了近年来滇重楼的研究现状,主要包括分类与系统、化学成分和药理活性、繁殖生物学以及遗传多样性等方面的工作;同时,提出了存在的问题和建议。将为今后更深入地开展滇重楼优质种质引种驯化,实现种质资源多样性的合理保护和可持续利用提供参考。     

镧对华重楼生长及皂苷含量的影响

本研究以4年生华重楼（Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara）为实验材料,分别采用0、5、20、80、160 mg/L的加镧营养液培养华重楼植株,通过比较不同营养生长指标及采用HPLC法测定根茎皂苷组分,研究不同施镧水平对华重楼生长及皂苷含量的影响。结果显示,镧对华重楼生长及皂苷含量均有显著影响,随着镧溶液浓度的增加,华重楼皂苷含量呈上升趋势,但当镧含量达到160.00 mg/L时,则会对华重楼的生长产生抑制作用,导致株高降低、比叶面积升高。研究结果表明80.00 mg/L的施镧水平最有利于华重楼的营养生长及根茎皂苷积累。     

Cloning and Functional Characterization of a Squalene Synthase from Paris polyphylla var. yunnanensis

Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand. – Mazz. is a precious traditional Chinese medicine, and steroidal saponins are its major bioactive constituents possessing extensive biological activities. Squalene synthase (SQS) catalyzes the first dedicated step converting two molecular of farnesyl diphosphate (FDP) into squalene, a key intermediate in the biosynthetic pathway of steroidal saponins. In this study, a squalene synthase gene (PpSQS1) was cloned and functionally characterized from P. polyphylla var. yunnanensis, representing the first identified SQS from the genus Paris. The open reading frame of PpSQS1 is 1239 bp, which encodes a protein of 412 amino acids showing high similarity to those of other plant SQSs. Expression of PpSQS1 in Escherichia coli resulted in production of soluble recombinant proteins. Gas chromatography-mass spectrometry analysis showed that the purified recombinant PpSQS1 protein could produce squalene using FDP as a substrate in the in vitro enzymatic assay. qRT-PCR analysis indicated that PpSQS1 was highly expressed in rhizomes, consistent with the dominant accumulation of steroidal saponins there, suggesting that PpSQS1 is likely involved in the biosynthesis of steroidal saponins in the plant. The findings lay a foundation for further investigation on the biosynthesis and regulation of steroidal saponins, and also provide an alternative gene for manipulation of steroid production using synthetic biology.     

产甾体皂甙华重楼内生真菌、放线菌的分离与筛选

目的:研究重楼内生菌的次生代谢产物的医用价值。方法:从产自四川彭州的华重楼(Paris polyphylla vat．chinensis Franch)地下块茎中分离、筛选内生菌,采用PDA液体培养基26℃发酵培养;发酵液分别经泡沫反应、Salkowski反应、Liberman反应及以薯蓣皂甙元为标准对照的薄层层析分析。结果:表明其中编号为SNUF-1的真菌和编号为SNUA-1、SNUA-2的放线菌菌株均能分泌甾体皂甙或其类似化合物。结论:华重楼内生菌发酵液具有产生宿主药用活性的成份。     

一株产重楼皂甙内生细菌的分离与鉴定

从产自四川彭州的华重楼(Parispolyphyllavar·chinensisFranch)地下块茎中分离得到16株菌。经以薯蓣皂甙元为标准对照的薄层层析分析,表明其中编号为SNUS-1(AY842149)的菌株能分泌重楼皂甙或其类似化合物。16SrDNA序列(约1,500bp)系统发育分析表明:菌株SNUS-1与Pseudomonastolassii(AF255336)和Pseudomonastolassii(D84028)的遗传距离分别为0和0·003,在系统进化树上三者又严格聚为一族,结合形态及生理特征确定其为托氏假单孢菌(Pseudomonastolassii)。     

中国重楼属(延龄草科)一新变种——攀西直瓣重楼

描述了延龄草科一新变种--攀西直瓣重楼(Paris polyphylla Smith var.panxiensis J.L.Liu),并绘制了形态图.新变种以其叶片狭长、条形而与狭叶重楼(Paris polyphylla Smith var.stenophylla Franch.)和小重楼(Paris polyphylla Smith var.minor S.F.Wang)相近似,但又以花瓣线状圆柱形、直立、不弯曲、远短于萼片、向上逐渐增粗呈棒状、先端圆形或钝圆,花药药隔明显头状突起而有明显区别.     

产甾体皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定

从华重楼(Paris polyphyllavar.chinensisFranch)的地下块茎中分离筛选得到2株可能产生甾体皂甙的内生菌(SS01和SS02),薄层层析检测菌株SS01、SS02的发酵产物分别有3条和2条层析带与重楼总皂甙的层析带迁移率相当。形态和生理生化特征初步表明SS01和SS02分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和芽孢杆菌属(Bacillussp.)细菌。扩增、测序得到SS01和SS02的部分16S rDNA序列,GenBank接收号分别为AY842143和AY842144。用Blastn调出与菌株16SrDNA同源的序列,用Clustal W进行多重序列对比,用软件Phylip按Neighbor-Joining方法构建16SrDNA系统发育树。菌株SS01和SS02分别与Cedecea davisae DSM4568、Paenibacillus daejeonensis处于同一分支,相似性分别为98.9%和97.7%,将它们鉴定为Cedecea davisae SS01和Paenibacillus daejeonensis SS02。