含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

含融合杀虫基因和VHb基因双价表达载体的构建

目的：探索分子育种的新途径,获得高产多抗虫谱的转基因植物。方法：将密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（vgbM）基因与融合杀虫基因（GFMcryIA＋CPTI）构建成双价基因植物高效表达载体pGBI4ABCVHB,基因表达盒中含2个增强子、35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子以及正确切割、加工序列、Poly（A）信号序列。结果：通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株,结论：vgbM基因在转基因烟草中有效表达;融合杀虫基因也表达出活性毒蛋白。     

双价抗虫基因植物表达载体的构建

将蝎毒基因BmKITS和几丁质酶基因chitinase2个抗虫基因采用不同的启动子ubi或35S,连到2个高效的植物表达载体pWM101和pBI101中,2个重组表达质粒分别经过限制性酶切分析和PCR鉴定,实验结果表明2个含有双价抗虫基因的植物重组表达质粒均已构建成功．     

一种快速构建35S组成型植物双价表达载体的方法

通过对几种常用植物表达载体的35S和Tnos序列进行比对,设计带有酶切位点的引物35S和Tnos,通过PCR克隆了同时带有35S和Tnos序列的目的基因片段,通过定向的酶切、连接获得双价表达载体.此方法简化了植物双价表达载体构建过程,具有明显时间短、效率高、不需要中间载体、检测简单等特点,而且引物对于多数常用35S组成型植物表达载体是通用的,为快速构建35S组成型植物双价表达载体提供了一种新方法.     

含甘露糖异构酶基因植物表达载体的构建

目的:构建了以manA基因为选择标记的植物表达载体。方法:从大肠杆菌DH5α中克隆出manA基因,连接到质粒pCAMBIA1301的XhoⅠ位点,替换hpt基因,通过酶切和PCR检测了插入片段的正确性,使用XbaⅠ和HindⅢ酶切Gateway载体(pGWCBF)获得含有P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB的结构域,将其插入到表达载体pCAMBIA1301的相应位点中,获得中间表达载体pCAMBIA1301-manA-GW,使用Gateway载体的BP反应与LR反应,将转录因子CBF基因片段整合到载体中。结果:酶切结果表明以甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF已经构建完成。结论:将构建好的载体用液氮冻融法转化到农杆菌中,可以用于葡萄的遗传转化研究,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础。     

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因sgna的现有载体进行了改造,并引入筛选标记基因bar;为提高目的基因的表达水平,在目的基因5′端引入了Ω和kozak序列,3′端引入了poly(A)序列,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,基因pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-sgna及Ubi-bar基因表达盒,pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaNV35S-nptⅡ,Ubi-sgna和Ubi-bar基因表达盒,人工合成的雪花莲外源凝集素基因sgna可以编码对同翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

利用pBIN19、pGFP和pCHS质粒, 成功构建了CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP, 并导入野生型发根农杆菌K599。矮牵牛的转化实验表明, 矮牵牛离体叶片被发根农杆菌K599(带pBIN-35S-GFP质粒)感染生根率达45%。对诱导的不定根基因组DNA的PCR检测表明, 不定根基因组中含有发根农杆菌K599 Ri质粒中的rolB基因和外源gfp基因;转基因不定根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光, 表明构建的转基因载体pBIN-35S-GFP能实现gfp基因的高效表达。该载体在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点, 可以方便地进行启动子替换, 用于研究不同启动子的功能。此外, 该载体在gfp基因的5'端含有多克隆位点, 在3'端含有EcoRⅠ和BsmⅠ两个单一酶切位点, 可以方便地在5'端连接上目标基因, 表达含GFP的融合蛋白, 进行目标基因编码蛋白的亚细胞定位; 也可以方便地切除gfp基因, 连上需要的目的基因进行转化。     

多基因植物表达载体的构建

将功能互补的抗真菌病基因或抗虫基因共同转化水稻植株,可望获得既抗病又抗虫的转基因水稻植株,马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PinⅡ,苏云金杆菌毒蛋白CryⅠ(b)基因B.t.,以及PPT乙酰转移酶基因bar构建在一个载体上,水稻碱性几丁质酶基因RC24与大麦核糖体失活蛋白基因B-RIP构建在另一个载体上,两载体共同转化水稻植株的工作正在进行之中。Ⅱ     

番木瓜环斑病毒YsCP基因的序列分析和植物表达载体的构建

用双脱氧链终止法分析了克隆的番木瓜环斑病毒（PRV）Ys株系外壳蛋白（CP）基因的序列,结果表明YsCP基因全长858nt。对PRV国内外16个株系或分离物CP基因的比较发现,YsCP基因与国内株系或分离物CP基因的同源性较高（94．44％～97．68％）,而与国外株系或分离物CP基因的同源性较低（88．88％～92．70％）。CP基因之间的差异主要靠近基因5’端,特别是在YSCP基因第63nt后连续缺失6nt,SmGTHAI和SRI的CP基因也在此处缺失3nt。将YsCP基因插入中间质粒pRokⅡ的CaMV35S启动于和nos终止序列之间形成CP基因的植物表达载体pRPCY,通过三亲交配使pRPCY进入农杆菌LBA4404,与其中的pAL4404构成双元载体系统。     

phyA基因新型表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

利用自行筛选、鉴定的黑曲霉F246,根据植酸酶基因(phyA)成熟肽编码序列设计引物,直接PCR扩增phyA,经酶切分析、DNA测序和氨基酸序列分析证实phyA基因克隆成功。从pMD18T-phyA克隆中获得phyA编码序列,将其与pET30a 质粒连接,构建pET30a -phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组质粒经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为50kDa,此重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的36.62％,酶活性较天然植酸酶高8倍以上。因此,该phyA基因具有正常的生物学功能,对其进行深入研究,为大量获得高活性植酸酶以及开发新型微生态制剂奠定了基础。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。     

诱导人参发根的rolC基因植物表达载体构建及其在人参中的表达

根据Slightom等RiA₄TL-DNA序列分析结果 ,设计了一对引物 ,以R_i 质粒DNA为模板 ,利用PCR方法对rolC基因进行了扩增。利用pGEM-T载体对rolC基因进行了克隆和测序。结果 ,克隆的DNA片段序列与报道的ORF12阅读框内的rolC序列一致。将pGEM-T-rolC用限制性内切酶SacI酶切 ,与经SmaI酶切CIAP去磷酸化的pUC19质粒重组 ,经蓝白斑筛选得到正向重组的pUC19-rolC。再用Xbal-SacI双酶切pUC19-rolC与pBI121 ,将rolC基因定向克隆到具有CaMV35S启动子的pBI121表达质粒上 ,构建成植物表达载体pBI-rolC。用pBI-rolC转化农杆菌LBA4404构建成的LBA4404 (pBI-rolC)工程菌转化人参子叶 ,获得发根的表达。经PCR扩增分子检测 ,证明rolC基因确已整合到人参发根基因组中。经对转化的人参发根中单体皂苷含量测定 ,发现发根中含有所检测的 7种人参单体皂苷 ,总皂苷含量达 18.55mg/g。     

CBF4基因植物表达双元载体的构建

目的:对拟南芥CBF4基因序列进行克隆.方法:用限制性内切酶将CBF4基因从pMD18-T CBF4载体上切下,定向连接到含超强启动子的pC2301-35S-OCS表达载体上,成功构建了CBF4基因植物表达载体pC2301-35S-OCS-CBF4.利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,提取转化质粒,经PCR扩增和酶切验证鉴定表明.结果:CBF4基因植物表达双元载体构建成功.结论:转CBF4基因烟草的抗寒性比野生型烟草要高.     

抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus retrojflexus agglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白.把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功.将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株.     

蝴蝶兰LFY基因克隆及高效植物表达载体的构建

根据NCBI中蝴蝶兰LFY花序分生组织基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从蝴蝶兰花芽中扩增出LFY基因,对扩增产物进行克隆和测序.结果表明,获得的蝴蝶兰LFY基因约为1500 bp,与报道序列同源性达98.71％.将LFY基因插入pRI101-ON载体中,经PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体pRI1O1-LFY.