双原核注射提高转基因的整合效率(英文)

本文提出了受精卵双原核注射方法,利用共注射具有部分同源区的两个片段鼠乳消酸蛋白基因 (WAP) 调控序列控制下的人粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) (Fig.1),通过PCR和Southern Blot检测了8细胞期外源基因的整合(Fig.2)。结果表明,与单一原核注射相比较,双原核注射转基因的整合率由单一原核注射的48.68%提高至62.65%(Table 1)。这为转基因动物建立,提高外源基因整合率提供了新途径。     

外源基因在转基因小鼠中遗传和表达的稳定性

通过显微注射将外源构件λ１０６（年α－Ｓ１酪蛋白基因调控区指导的乙肝病毒表面抗原基因表达构件）导入小鼠受精卵中,用ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ方法进行外源基因的整合检测、ＥＬＩＳＡ法进行外源基因的表达检测,对４代转基因小鼠进行了跟踪测定,结果表明：的代转基因小鼠的整合率为５６％,原代雌鼠乳汁中转基因产物的表达率为１００％;传代跟踪基因的整合率不符合“单一位点随机整合”的假说,家系分析推测外源基因在受精卵     

鼠体突变型p53外源基因的垂直传递和转位观察

外源基因用于制作转基因鼠并能成功地传递到子代已是不争的事实。但是,有关研究转基因的大小以及对其功能的影响却鲜见报导。本实验对体突变型p53基因－作为外源基因在172^Arg-Leu－体突变型p53基因的双转基因鼠家系中的遗传行为进行了研究。以体突变型p53基因的XhoI-ApaLI片段为探针,对雌性双转基因鼠＃4491及其子代进行Southern blot分析（Fig.2)。通过Betagen Meter测定,比较杂交膜上探针的吸附量得知：子鼠＃5074等体内的外源p53基因的拷贝数是其亲本34491的3倍。Fig.1为＃4491与雄性FVB鼠杂交后代的家系谱。杂交F1的子代中,那些外源p53基因拷贝数是其亲代（F1）3倍的鼠（如＃5071和＃668）、其后代中继续出现这种基因拷贝数的变化。取待测鼠＃5074的脾细胞制备染色体,经G染色,以WAP－双转基因－SV40连结p（A）的结构为探针,进行原位荧光测定。Fig.3表明：b所指的外源p53基因从所在的染色体上发生跳跃（jump in),出现在c和d所指的位置上。可能,整合在＃4491染色体上的外源p53基因有两组,一组是稳定整合的,传代时,可以被传递到所有子代上;另一组是非稳定整合的,由于一些未知因素,在传递过程中被扩增、并发生了跳跃现象。也许,特定位点上转基因的拷贝数有一个限量,适量则稳定;反之、则不稳定。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

显微注射法制备转基因小鼠模型的研究

将外源基因ＭＴ０ＬＭＰ,ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ１）－ＬＭＰ及ＨＬＡ－ＤＲα分别注入昆明小鼠受精卵雄原核中,结果得到有这三种外源基因整合的三个转基因小鼠系,导入基因的整合率分别为８％,８０％骸６６．７％,它们的子一代及子二代（Ｆ２）基因中也均有外源基因整合,并且导入ｐＺｉｐ－ＮｅｏＳＶ９Ｘ１）－ＬＭＰ基因后经反转录聚合酶链反应,检测ｍＲＮＡ发现有该基因的表达,说明本法制备转基因小鼠是可行的。应用荧光     

血管内皮生长因子 (VEGF1 83)转基因小鼠的建立(英文)

采用显微注射法 ,将一个由 1.3kb人感光细胞间维生素A类结合蛋白 (hIRBP)启动子区和人血管内皮生长因子 (hVEGF183)cDNA所构成的融合基因片段HIRV183导入 2 89枚ICR小鼠受精卵的雄性原核 .制备当代 (G0 )转基因小鼠 ,共得G0 代小鼠 17只 .经PCR和PCR Southern方法筛选得到 1只为hVEGF183转基因阳性小鼠 ,整合率为 5 9%,转基因总效率为 0 3%.将其与正常ICR小鼠交配 ,经PCR和dot blot杂交鉴定后代 (F1)小鼠阳性整合率为 4 5 9%.F1代兄妹之间进行交配 ,后代 (F2 )小鼠阳性整合率为 6 7 6 %.结果表明 ,外源基因hVEGF183整合在小鼠染色体的单一位点 ,为以后利用转基因动物的方法对VEGF这个新型异构体VEGF183进行深入研究打下了基础     

全鱼基因的构建及其在鲫鱼体内的整合与转录

利用PCR技术删除大麻哈鱼生长激素基因的启动序列,通过基因重组构建出全鱼基因（鲤鱼MT启动子－大麻哈鱼生长激素基因）;以融合全鱼基因为外源基因,通过显微注射方法将其线性片段导入鲫鱼受精卵内,研究其整合与转录效率。结果表明,全鱼基因在鲫鱼基因组中的整合率为36．4％（16／44）,对转基因阳性鱼的RNA样本进行Northern印迹杂交检测,转录率为25％（1／4）。因此,该全鱼基因可以作为转基因鱼研究和应用的外源基因。     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

外源基因在鲤鱼受精卵细胞不同发育时期整合效率的研究

显微注射技术是构建转基因鱼的基本基因导入技术,在受精卵的不同发育时期注射外源基因,外源基因在受体鱼基因组的整合率是不同的,受精卵的成活率也不一致。本文报道了鲤鱼受精卵在其不同的发育时期,注射外源基因与其成活率,整合率的关系。     

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位,应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明,外源基因是以单拷贝、单位点形式整合;应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明,该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区;反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示,获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代.     

转基因猪染色体原位杂交外源生长激素基因定位

近些年来随着原位杂交技术的不断改进,该技术已广泛用于染色体的基因定位。非放射性标记探针的应用使基因定位变得更加简单易行,从而有可能对动物的转基因进行定位研究。本文首次采用胶体金标记药盒（Anti-digoxigenin-gold)和银加强试剂（Silver enhance-ment reagents)的非同位素原位杂交技术对转基因猪外基因进行了定位研究。如Fig.1所示：表达质粒pSMTPGH含有载体pUC19,羊启动子MT011和猪生长激素PGH基因。选5头带有pSMTPGH的转基因猪,分别制备含有染色体DNA的杂交膜。用BglII和Smai对pSMTPGH进行完全酶切,收集0．9kb片段作为探针,以dig-11-dUTP进行标记。探针与DNA杂交后,用光学显微镜检查。选择分散良好、显影银颗粒清楚的玻片进行摄影记录（Fig.2)。对染色体上的显影银颗粒进行统计分析,参照家猪的染色体标准带型,确定外源PGH基因整合位点。Fig.3为4104号转基因猪染色体上的银颗粒分布情况。对5头转基因猪外源PGH基因定位的结果见Table1。探针的合理设计是外源基因定位研究成功的关键。本实验所用探针必须地与外源PGH基因杂交,而不受内源PGH基因的影响。我们设计的探针符合这一要求。采用dig11－dUTP标记探针,抗体金显色,银加强试剂放大杂交信号,在光学显微镜下可以直接观察杂交位点处的显影银颗粒,但于对实验进行统计分析。估计数据表明：转基因猪的外源PGH基因随机整合在所有染色体上,但在13号染色体上的机率略高。     

TNNT3~（R69H）突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-TNNT3（R69H）转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3（R69H）注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达。结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠。对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3（R69H）在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。     

突变型p53Neu／erbB2双转基因鼠的培育—乳腺定位高表达突变型p53Neu／erb32

为了研究乳腺癌发生与发展过程中突变型p53和Neu基因之间的相互作用,我们构建了p53/Neu双转基因鼠。用5只成年雄性Neu转基因鼠与10只成年雌性p53转基因鼠交配,对150只雌性杂交后代鼠进行p53/Neu双转基因鼠的筛选。为此,本实验建立了PCR－一步鉴定法。即：在同一个反应管内能同时满足小鼠β－酪蛋白基因、p53基因和Neu基因上三个片段（分别为0．5kb、1.2kb、1.7kb）的扩增反应者被判定为双转基因鼠（Fig.1)。传统的Southern分析（Fig.2)与PCR一步法鉴定结果相吻合。证明：该法的准确率为100％,进一步、随机取样,Northern分析（Fig.3)表明：双转基因鼠（2号）在哺乳第二天即出现p53基因的高。继而、在姓娠第10、17天,哺乳第10、21天也检测到该基因的表达。另外,免疫组化染色也检测到了p53和Neu蛋白（未展示结果）。     

用直接注射法生产转基因鱼

本文报道了对鲤鱼、鲫鱼受精卵不加任何去膜处理,用显微操作器把外源基因直接注射到卵核附近,构建转基因鱼的方法。本法操作方便,孵化条件简单,成活率高。斑点杂交和Southern Blot杂交结果表明,外源基因的整合率与其它方法构建的转基因鱼的外源基因的整合率相近。从1988年至今,本组运用这个方法生产转基因鲤鱼、鲫鱼一万余尾。     

人促血小板生成素在转基因小鼠乳腺中定位表达的研究

通过转基因动物乳腺生物反应器大规模生产药用蛋白质已成为现代生物技术新的生长点之一。为研制表达人促血小板生成素的哺乳动物生物反应器的转基因小鼠模型,本论文以小鼠乳清酸蛋白（mWAP)基因5‘端调控区和牛α-sl-酪蛋白基因3‘端调控区作为调节元件构建了用于表达人促血小板生盛开纱的乳腺组织特异性表达载体pWAPTPO(Fig.l)。通过常规显微注射的方法把mWAP启动子指导的hTPO表达载体导入小鼠受精卵,获得出生小鼠16只,经PCR检测,有6只为转基因阳性（Fig.2)。G0代小鼠中转基因整合率为37.5%(6/16),用ELISA方法在G0代转基因雌鼠的乳汁中检测了促血小板生成素的表达,表达量在0.8μg/mL以上（Tablel)。这些结果表明我们已建立了乳腺表达hTPO的转基因小鼠模型,为以后大型家畜乳腺生物反应器的研制提供了科学依据。     

转基因鱼构建模式的研究 I．cMT—sGH全鱼基因鱼的构建与检测

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一顶重要研究利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达,已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（cMT）与大巴哈鱼生长激素基因（sGH）的融合基因（cMT-sGH)导入鲤鱼半日细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼基因鲤鱼。通过斑点杂交、Southern blot结合PCR－Southern blot,对外源sGH的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过转基因注射,孵化后的鱼苗放入水族。待鱼平游,提取总DNA进行检测。以PstI酶切质粒pcMTsGH(Fig.4)分离3．4KbsGH片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成sGH基因的PCR特异引物。Fig.1的斑点杂交结果与Fig.2的PCR－Southern结果相比较（Table1),说明斑眯杂交存在着高的假阳性。而PCR－Southen将PCR的快速、方便与Southern的准确性相结合,排除了PCR本身可能的非特异,大大提高了检测效率,同时也检验了引物的设计是否成功。Table1的结果表明：我们所构建的基因鱼达到了37．7％的高整和率,且稳定性好。高整和率的原因与所使用的基因元件有很大关系。Fig.3基因组的Southern行为－PstI和BglII酶切的杂交信号条带多、共迁移,说明基因的整和方式为多拷贝,可能伴有碱基修饰。这可能是表达率降低的重要原因。     

转基因猪外源生长激素基因的定位研究——非同位素标记染色体原位杂交技术

近几年来发展起来的染色体原位杂交技术是进行基因定位研究的重要手段。它为进一步进行基因定点整合研究提供依据。本文采用非同位素标记染色体原位杂交技术对经显微注射得到的转基因猪进行了内源和外源猪生长激素(PGH)基因在染色体上定位的研究。 用BhlI对pSMTPGH注射基因(本室制备)进行单酶切,选取3.5kb片段以Dig进行标记。为了提高灵敏度,我们采用了胶体金标记抗体技术并结合使用银增加试剂。利用染色体的组型分析,对杂交点的分布进行了统计学分析,发现内源PGH基因位于12p~(11),与国外Thomsen,P.D.等报道的一致。插入的外源PGH基因呈随机分布,但对某一转基因猪来说,外源基因的插入是集中在某一染色体上。这一结果的发现为进行转基因猪外源基因定点整合提供了依据,也为研究外源基因整合位点和转基因猪表观性状的关系准备了条件。     

通过双原核显微注射提高转基因小鼠研制效率的实验研究

目的建立高效的转基因小鼠制备技术,为开展遗传工程动物模型研究奠定技术基础。方法通过向小鼠受精卵原核中注入不同浓度的DNA分子,筛选最适注射用DNA浓度;将K14/hCTLA4-Ig基因表达载体分子通过显微注射分别导入小鼠受精卵雌、雄原核,并设立单原核注射对照组;利用输卵管腹壶部穿刺移植法将注射后的小鼠受精卵移植于同期发情的受体母鼠;利用PCR对出生的转基因首建小鼠进行筛选。结果最适DNA分子浓度为10ng/μl;在单、双原核注射组胚胎2细胞卵裂率分别为52.3%(132/253)和45.0%(108/240),差异有显著性(P<0.05);注射胚胎移植后体内存活率分别为18.1%(24/132)和16.7%(18/108),差异无显著性;转基因首建小鼠阳性率分别为3/24和5/18,转基因阳性小鼠占总注射胚胎的比例为1.2%(3/253)和2.08%(5/240),差异有极显著性(P<0.01)。结论尽管双原核注射对胚胎的2细胞卵裂率有一定影响,但通过双原核注射可有效提高转基因小鼠的制备效率。     

转基因植物外源基因的整合分析

外源基因表达的不稳定性和多样性是制约转基因作物育种研发进度的关键因素,外源基因的整合情况与外源基因的表达直接相关,充分了解外源基因的整合情况可为构建高效表达载体、获得外源基因稳定一致表达转基因材料提供参考,同时为转基因作物的安全利用提供保障.就外源基因整合情况的分析方法、不同转化方法外源基因的整合特点及利用定点整合技术提高外源基因表达稳定一致性的研究进展作一概述.     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。