家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

菲律宾实蝇生物学特性研究

菲律宾实蝇Bactrocera (Bactrocera) philippinensis (Drew & Hancock)是重要的检疫性有害生物, 严重危害芒果Mangifera indica L.、木瓜Carica papaya L.和菠萝蜜Artocarpus heterophyllus Lam.等水果。本文在室内实验条件下对菲律宾实蝇生物学特性进行了较为系统的研究。结果表明: 菲律宾实蝇在6~18 h羽化率达93.93%。成虫活动、寿命、交配和产卵与温度、光照密切相关。补充营养能显著延长成虫寿命。菲律宾实蝇生长、发育和繁殖的适宜温度为25~30℃。25℃和30℃时平均产卵量分别为627.35粒和652.57粒。发育起点温度和世代有效积温分别为14.31℃和450.43日·度。温度与发育历期呈显著的负相关（r=-0.9005）。本研究为菲律宾实蝇的检疫处理和田间防治技术研究提供了重要的基础资料。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N（aminopeptidase N, APN）和钙粘蛋白（cadherin）是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles, BBMV）上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA（dsRNA）注入棉铃虫4龄幼虫体内, 以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明: 注射dsRNA（1 μg/头）进行基因沉默后, Haapn1 mRNA表达量比注射缓冲液（elution solution, ES）的对照下降了30%~49%, Ha_BtR mRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1 dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm² Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫, 而在 100 和 170 μg/cm² Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异; Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtR dsRNA后, 干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体, 这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示, Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。     

棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

感染稻水象甲的Wolbachia基因组中插入序列的鉴定与分析

共生细菌Wolbachia对宿主的生殖起多种调控作用。以往研究表明, Wolbachia基因组中广泛存在插入序列(insertion sequence, IS), 它们对宿主基因组的可塑性、 多样性和进化起重要作用。稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel在东亚是一种外来水稻害虫, 在原产地北美营两性生殖, 而在所有入侵地均营孤雌生殖。本研究采用PCR法从河北唐海孤雌生殖型稻水象甲体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp4和ISWosp6; 从美国德克萨斯州两性生殖型稻水象甲成虫体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp3和ISWosp5。碱基序列比对显示: ISWosp3和ISWosp4属于IS3家族IS3组成员, ISWosp5为IS4家族IS231组成员, ISWosp6为IS5家族IS1031组成员。对这些IS的ORF结构、 所编码氨基酸序列的结构等进行了分析, 推测ISWosp5具有潜在转座活性。所得结果增进了我们对Wolbachia IS3, IS4和IS5家族插入序列的认识, 同时为今后从IS的角度探讨Wolbachia与稻水象甲生殖的关系奠定了基础。     

光肩星天牛体内纤维素酶活性及其与寄主选择的关系（英文）

为了揭示光肩星天牛Anoplophora glabripennis Motschulsky纤维素酶与寄主选择的关系, 以4种不同寄主树种（新疆杨Populus alba var. pyramidalis Bunge、箭杆杨Populus nigra var. thevestina (Dode) Bean、合作杨Populus simonii × Populus pyramidalis cv. opera Hsu和漳河柳Salix matsudana f. lobato-glandulosa Faug et Liu来源的光肩星天牛幼虫, 和以取食5种不同树种（臭椿Ailanthus altissima、毛白杨Populus tomentosa、合作杨、旱柳Salix matsudana Koidz.和复叶槭Acer negundo Linn.）的光肩星天牛成虫为实验对象, 测定其纤维素酶活性。结果表明: 不同寄主来源的光肩星天牛幼虫内切-β-1,4-葡聚糖酶活性在1.36~2.71 μmol葡萄糖/ (g FW·h)之间, β-葡萄糖苷酶活性在2.57~4.86 μmol葡萄糖/(g FW·h)之间;取食不同树种的光肩星天牛成虫内切-β-1,4-葡聚糖酶活性在4.08~9.27 μmol葡萄糖/(g FW·h)之间, β-葡萄糖苷酶活性在2.87~6.08 μmol葡萄糖/ (g FW·h)之间。不同寄主树种来源的光肩星天牛幼虫体内纤维素酶活性无显著性差异, 取食与否以及取食树种的不同对光肩星天牛成虫纤维素酶活有较大影响。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。     

中国菲寄蝇属分类研究(双翅目: 寄蝇科)

经研究发现中国菲寄蝇属现共有9种,其中包括4新种：金额菲寄蝇Phebellia aurifrons sp. nov.,褐粉菲寄蝇Ph. fulvipollinis sp. nov.,宽叶菲寄蝇Ph. latisurstyla sp. nov.和毛基节菲寄蝇Ph. setocoxa sp. nov.。我国新记录3种：叶蜂菲寄蝇Ph. clavellariae (Brauer & Bergenstamm),灰粉菲寄蝇Ph. glauca (Meigen)和拟灰粉菲寄蝇Ph. glaucoides Herting。本文除详细描述新种特征及绘制特征图外,还提供中国菲寄蝇属已知种类的分种检索表。     

辣椒碱对小菜蛾的驱避活性及其体内谷胱甘肽-S-转移酶和Na+，K+-ATP酶活性的影响

采用常规生测方法和酶活力测定方法,初步研究了辣椒碱对小菜蛾Plutella xylostella L.的产卵忌避和拒食作用,及其对小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶、Na⁺,K⁺-ATP酶活性的影响,以期阐明辣椒碱对害虫的作用机制。结果表明,辣椒碱对小菜蛾表现出较强的产卵忌避活性和拒食活性。在6.25×10⁴ mg/L浓度下,处理24 h辣椒碱对小菜蛾的非选择性产卵忌避率达96.55%,选择性产卵忌避率为84.30%;在相同浓度下,处理48 h辣椒碱对小菜蛾的非选择性拒食率达81.47%,选择性拒食率为69.69%。 另外,经1.25×10⁵ mg/L辣椒碱不同时间处理后,小菜蛾体内的谷胱甘肽-S-转移酶酶活力和Na⁺,K⁺-ATP酶活力与对照相比均产生了波动,处理18 h时小菜蛾体内GSTs活力最高,为152.01 U·mg^-1pro·min^-1,处理1 h时小菜蛾体内Na⁺,K⁺-ATP酶活力最高,为19.99 U·mg^-1pro·min^-1。结果说明辣椒碱能够影响小菜蛾产卵和取食行为,并且对其体内的酶系也产生了影响。     

自同安钮夜蛾幼虫分离的一种核型多角体病毒

对在林间导致同安钮夜蛾Anua indiscriminate Moore幼虫死亡的一种病原物进行了分离和鉴定,并对该病原物进行了室内毒力测定。结果表明：该病原物为核型多角体病毒, 定名为同安钮夜蛾核型多角体病毒(AiNPV)。其对同安钮夜蛾幼虫的致死浓度LC₅₀和LC₉₀分别为3.4×10⁴和3.8×10⁷ PIB/mL。     

脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊的毒力及几种酶系的影响

采用药膜法测试了脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊Periplaneta americana初孵若虫的触杀活性,并测定了其对成虫中枢神经系统乙酰胆碱酯酶（AChE）和腺苷三磷酸酶(ATPase)离体活性的影响。结果表明：脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊初孵若虫具有较强的毒杀活性,在接触时间24、48、72和96 h 的LC₅₀分别为26.26、4.68、1.51和0.62 μg/cm²;其对AChE没有明显影响; 对Na⁺ -K⁺ -ATPase有明显抑制作用,并存在浓度 效应关系,IC₅₀为44.9 μmol/L; 对Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase表现出低剂量激活,高剂量抑制的现象。结果提示美洲大蠊的AChE不是脱氧鬼臼毒素靶标,而ATPase可能是脱氧鬼臼毒素的重要靶标之一。     

中华蜜蜂信息素结合蛋白ASP1 cDNA的克隆及时空表达

信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫信息素的识别、传递和处理过程中具有重要作用。本研究首次克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana的一个PBP基因Ac-ASP1（GenBank序列号为DQ449670）,其预测蛋白具有典型的气味结合蛋白（OBPs）标志（即成熟肽含有6个保守的半胱氨酸）。利用real-time PCR技术对Ac-ASP1在中蜂不同组织和发育历期的时空表达谱进行了鉴定。绝对定量结果显示Ac-ASP1高丰度地表达于工蜂触角（2.07×10⁶ 拷贝数/μg）,而在其他组织（如头、胸、腹、翅及足）中呈低丰度表达（10²拷贝数/μg）; 相对定量结果显示Ac-ASP1在各发育历期如幼虫、蛹以及成虫发育早期（1～6日龄）均有大量表达,而在21日龄前后具有另外一个高丰度表达时期。这些结果可为明确Ac-ASP1在中蜂蜂王信息素信号识别传递过程中的作用提供参考。     

胡芦巴超临界CO2萃取物的萃取条件优化及其对谷蠹的触杀活性

对胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.中杀虫活性成分进行超临界CO₂萃取分离,并以主要储粮害虫谷蠹Rhyzopertha dominica Fabricius为对象,对其触杀活性进行研究。采用正交试验设计,以萃取液中活性成分的得率、毒力为考察指标,对杀虫活性成分的提取条件进行优化。结果表明：最佳萃取工艺为萃取压力25 MPa,萃取温度55℃,夹带剂为95%乙醇,固液比为200 g:30 mL。萃取压力和夹带剂体积对试验指标有非常显著的影响,萃取温度和夹带剂浓度的影响较小。优化后的萃取方案可达到5.96%的得率。萃取产物对谷蠹的触杀试验结果显示,优化后的超临界CO₂萃取工艺对胡芦巴中的杀虫物质具有良好的选择性,得到的萃取物对谷蠹处理10天后的致死中浓度为65.03 μg/cm²,触杀活性明显增加。     

玫烟色拟青霉对小菜蛾致病力的时间-剂量-死亡率模型模拟

小菜蛾Plutella xylostella是我国南方十字花科蔬菜上的重要害虫,已对田间常用的化学杀虫剂产生了严重的抗性。为寻找有效的小菜蛾生物防治措施,本实验研究了一株分离自家白蚁的玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus (SCAU-PFCF01)对小菜蛾2～4龄幼虫的致病力。实验采用浸液法,供试浓度为1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷个孢子/mL。结果表明：随玫烟色拟青霉孢子浓度的升高,小菜蛾的感病死亡率增加,在浓度为1×10⁷ /mL时,小菜蛾2、3和4龄幼虫的累计死亡率分别为96%、85%和80%。玫烟色拟青霉对小菜蛾各龄幼虫的致病力与供试龄期有关,其感病的敏感顺序为2龄、3龄和4龄。用时间 剂量 死亡率模型（time-dose-mortality model,TDM）对各龄幼虫的致病力数据进行模拟,所建模型均顺利通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验,表明模型拟合良好,并由模型估计出了该菌株对小菜蛾各龄幼虫的致死剂量与致死时间。2龄幼虫接种后第7天、3龄幼虫接种后第5天、4龄幼虫接种后第4天的LC₅₀估计值分别为1.17×10⁴、1.44×10⁴和5.21×10⁴ /mL,LC₉₀估计值分别为1.98×10⁶、3.82×10⁷和1.29×10⁸ /mL。玫烟色拟青霉对小菜蛾幼虫的致死时间与浓度相关,供试各龄幼虫的LT₅₀值随着孢子悬浮液浓度的增加而递减,在1×10⁵～1×10⁷ /mL的范围内,2龄幼虫的LT₅₀值从3.16天降低到1.72天,3龄幼虫的LT₅₀从3.21天降低到1.83天,4龄幼虫的LT₅₀从3.69天降低到2.04天。即2龄幼虫致死所需的时间最短,其次为3龄幼虫,4龄幼虫致死所需的时间最长。结果显示了该株玫烟色拟青霉在小菜蛾的生物防治中具较强的应用潜力。     

虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性及作用机理

为明确虫酰肼衍生物0593对家蚕Bombyx mori的毒性,本研究采用食下毒叶法测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性,观察了亚致死浓度下对家蚕生长发育的影响,并测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕幼虫体内保护酶的影响,对虫酰肼0593的作用机理进行了初步探索。结果表明：虫酰肼及其衍生物0593对2龄家蚕96 h的LC₅₀值分别为1.2863和0.3364 mg·L^-1,属高毒级药剂;虫酰肼及其衍生物0593在亚致死剂量下对家蚕的生长发育有明显的不利性,可使幼虫历期缩短0.5～2 d;处理组眠期体重、全茧量、蛹重和化蛹率与对照相比均显著降低;对4龄幼虫体内多酚氧化酶和几丁质酶也有较明显影响,虫酰肼及其衍生物0593处理家蚕,处理后6 h对体内多酚氧化酶有明显激活作用,12 h后表现出显著的抑制作用;虫酰肼及其衍生物0593对家蚕体内几丁质酶均有激活作用。0593对保护酶的影响较虫酰肼明显。结果提示虫酰肼及其衍生物0593对家蚕毒性高,对其生长发育和保护酶类均有不利性,不适合在桑园及其周边农田使用。