半夏蛋白变性过程的圆二色性研究

测定了半夏蛋白的紫外圆二色谱,远紫外谱显示不常见的单一的226nm负峰,[θ]_(220)=-4.42×10~3度·厘米~2/分克分子;近紫外谱给出295nm及286nm的正峰,248nm的负峰,265～280nm的宽蜂。这些CD蜂的蜂值因加入胍而降低,降低过程相互间大体平行,[θ]对胍浓度曲线的转折点都在2.75M胍左右,与一般蛋白质相同。还测定了6M胍中变性的半夏蛋白的重天然化过程,发现分两个过程,一快一慢。慢过程的一级反应速度常数是0.144分~(-1),快过程的是3.57分~(-1)。     

结晶半夏蛋白在6M 盐酸胍中的可逆变性

前文——“半夏蛋白的分离、结晶、生物活力和一些化学性质”中已报道,半夏蛋白经变性剂处理后解聚成为亚基。结晶半夏蛋白经6M 盐酸胍变性后,用分步透析法,即用缓冲液等体积递减稀释变性剂,最终“恢复半夏蛋白”于生理盐水中平衡,去除变性剂,可以重新天然化。去除胍的“恢复半夏蛋白”,分子大小、亚基结构和肽链构型不变,完全恢复其在小白鼠中抑制早期妊娠的活力,并能在天然半夏蛋白相同的结晶条件下再结晶。     

结晶半夏蛋白在6M盐酸胍中的可逆变性

前文——“半夏蛋白的分离、结晶、生物活力和一些化学性质”中已报道,半夏蛋白经变性剂处理后解聚成为亚基。结晶半夏蛋白经6M盐酸胍变性后,用分步透析法,即用缓冲液等体积递减稀释变性剂,最终“恢复半夏蛋白”于生理盐水中平衡,去除变性剂,可以重新天然化。去除胍的“恢复半夏蛋白”,分子大小、亚基结构和肽链构型不变,完全恢复其在小白鼠中抑制早期妊娠的活力,并能在天然半夏蛋白相同的结晶条件下再结晶。     

半夏蛋白的若干生物学性质

从半夏块茎鲜汁分离的半夏蛋白具有凝集细胞和促使细胞分裂的作用。在已测试的红细胞中凝集羊、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠和鸽的红细胞,但不凝集人、猴、猪和鸡、鸭、鹅、龟、蟾蜍、鳝的红细胞。半夏蛋白的血凝作用和已知的多种凝集素一样存在供血动物种属专一性。半抗原抑制试验结果,所测各种单糖、双糖、聚糖和糖蛋白中,只有甘露聚糖和含有寡聚甘露糖苷核心的甲状腺球蛋白有抑制作用,表明半夏蛋白只与甘露聚糖结合,且其分子上与糖互补的位置远远大于一个单糖分子的范围。是目前已知的唯一只与甘露糖而不与葡萄糖结合的一种具有凝集素作用的蛋白质。除红细胞外半夏蛋白亦凝集其它细胞,已测细胞中小鼠脾细胞、人肝癌细胞(QGY7703-3和7402)、艾氏腹水癌和腹水型肝癌细胞均被半夏蛋白凝集,但它不凝集大鼠附睾和猪大网膜脂肪细胞,虽然能和这两种细胞结合。提示半夏蛋白的细胞凝集作用不仅具有动物种属专一性并存在细胞类别专一性。半夏蛋白的促细胞分裂作用亦有动物种属专一性,它促使兔外周血淋巴细胞转化,但不促使人外周血淋巴细胞分裂。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)I-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)I-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)I-半夏蛋白与其受体的结合。     

大白菜病毒的圆二色性

曾从大白菜中纯化了烟草花叶病毒新株——大白菜病毒(CCV)。本文研究了它的圆二色性。它的近紫外圆二色(CD)谱在273nm显示一个大正峰,在273～300nm间有3个肩膀。近紫外CD谱形和TMV-HR株的相似。远紫外CD谱在221nm呈负峰,在208～209nm处有一个较弱的肩膀,197nm处有一强正峰。在pH5～10.8的范围里,CCV呈相同的CD谱。溶液中不同的盐浓度对CCV的CD谱没有明显影响。游离的CCV外壳蛋白质的CD谱呈双负峰,游离核酸的CD谱与一般RNA的CD谱相似。这些结果说明,CCV远紫外CD谱几乎完全由蛋白质组分贡献,近紫外CD谱可能说明病毒颗粒内RNA和蛋白质间有很强的相互作用。     

半夏蛋白的若干生物学性质

从半夏块茎鲜汁分离的半夏蛋白具有凝集细胞和促使细胞分裂的作用。在已测试的红细胞中凝集羊、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠和鸽的红细胞,但不凝集人、猴、猪和鸡、鸭、鹅、龟、蟾蜍、鳝的红细胞。半夏蛋白的血凝作用和已知的多种凝集素一样存在供血动物种属专一性。半抗原抑制试验结果,所测各种单糖、双糖、聚糖和糖蛋白中,只有甘露聚糖和含有寡聚甘露糖苷核心的甲状腺球蛋白有抑制作用,表明半夏蛋白只与甘露聚糖结合,且其分子上与糖互补的位置远远大于一个单糖分子的范围。是目前已知的唯一只与甘露糖而不与葡萄糖结合的一种具有凝集素作用的蛋白质。除红细胞外半夏蛋白亦凝集其它细胞,已测细胞中小鼠脾细胞、人肝癌细胞(QGY 7703-3和7402)、艾氏腹水癌和腹水型肝癌细胞均被半夏蛋白凝集,但它不凝集大鼠附睾和猪大网膜脂肪细胞,虽然能和这两种细胞结合。提示半夏蛋白的细胞凝集作用不仅具有动物种属专一性并存在细胞类别专一性。半夏蛋白的促细胞分裂作用亦有动物种属专一性,它促使兔外周血淋巴细胞转化,但不促使人外周血淋巴细胞分裂。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)Ⅰ-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)Ⅰ-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)Ⅰ-半夏蛋白与其受体的结合。     

大白菜病毒的圆二色性

曾从大白菜中纯化了烟草花叶病毒新株——大白菜病毒(CCV)。本文研究了它的圆二色性。它的近紫外圆二色(CD)谱在273nm显示一个大正峰,在273～300nm间有3个肩膀。近紫外CD谱形和TMV-HR株的相似。远紫外CD谱在221nm呈负峰,在208～209nm处有一个较弱的肩膀,197nm处有一强正峰。在pH5～10.8的范围里,CCV呈相同的CD谱。溶液中不同的盐浓度对CCV的CD谱没有明显影响。游离的CCV外壳蛋白质的CD谱呈双负峰,游离核酸的CD谱与一般RNA的CD谱相似。这些结果说明,CCV远紫外CD谱几乎完全由蛋白质组分贡献,近紫外CD谱可能说明病毒颗粒内RNA和蛋白质间有很强的相互作用。     

乙酰胆碱酯酶的圆二色性分析

本文对中国南海丁氏双鳍电鳐电器官(AchE)的CD光谱进行了研究,测定了不同pH,不同温度和不同浓度下AchE主链构象的变化.结果表明,AchE在酸性和碱性环境中,α-螺旋量均减少,且与活性有平行关系:当温度超过50℃时,α-螺旋量开始下降.温度升高至70℃,螺旋结构全部消失.酶蛋白浓度大于0.3mg/ml时,结构量变化不大,而在稀溶液中α-螺旋量则大大降低.本文在计算AchE主链结构量的基础上对其构象的稳定性作了进一步的讨论.     

色氨酸阻遏物与其操纵基因复合物的圆二色性研究

用圆二色性谱来确定色氨酸阻遏物与其操纵基因复合物在溶液中的构象变化。色氨酸阻遏物的圆二色性图谱表明它是一种富含α螺旋的蛋白质,通过比较加入Ｌ－Ｔｒｐ前和后的圆二色性谱,发现活性的与非活性的色酸阻遏物二级结构变化很小,ｔｒｐ Ｐ／Ｏ的圆二色性谱与它的单健、双链理论计算曲线对比,可近拟推测操纵基因在溶液中的存在状态。用色氨酸阻遏物对ｔｒｐ Ｐ／Ｏ进行确定,可以从中找出蛋白质与核酸结合的平衡点。从平衡时     

蛋白质二级结构的真空紫外圆二色性研究

利用同步辐射真空紫外圆二色谱仪和特制的样品池,测定溶液中蛋白质的真空紫外圆二色谱,测定波长低至175nm,并应用一种新的计算法分析计算了蛋白质5种二级结构的含量,所得结果与用X射线衍射法测定的结果一致.讨论了获得好的真空紫外圆二色谱的几个重要因素.结果表明,真空紫外圆二色法是目前测定溶液中蛋白质二级结构的较好方法之一.     

半夏蛋白的抗兔胚泡着床作用

半夏蛋白有很强的抗兔胚泡着床作用,子宫内注射500μg,抗着床率达100%。经半夏蛋白作用后的子宫内膜能使被移植的正常胚泡不着床。在子宫内经半夏蛋白孵育的胚泡移植到同步的假孕子宫,着床率随孵育时间延长而降低。用辣根过氧化物酶标记半夏蛋白的定位实验表明该蛋白结合在子宫内膜腺管的上皮细胞膜上。已知半夏蛋白有类似凝集素的活性,能与甘露聚糖结合,它的抗着床作用可能是由于该蛋白结合了母体和(或)子体细胞膜上的某些糖结构,改变了细胞膜的生物学行为所致。     

在不同物理化学条件下天花粉蛋白的圆二色性研究

用圆二色谱研究了天花粉蛋白在酸性和碱性溶液中的构象,并观察了在十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中天花粉蛋白分子构象的变化,用Chen,Yang与Martinez等人的方法计算了各种条件下天花粉蛋白二级结构含量.结果表明:在很宽广的pH范围内(从pH2到pH12)分子构象基本上是稳定的.但是,在强碱性条件下即pH>12(室温)或pH11.5(40℃)螺旋含量显著减少.在碱性条件下,于250nm附近出现一新的CD带,它的强度与离解的酪氨酸残基个数呈线性关系,说明这一新带主要是由离解的酪氨酸残基产生的.     

岩豆凝集素分子修饰与圆二色性的关系研究

天然态岩豆凝集素（ＭＤＬ）远紫外圆二色性（ＣＤ）谱显示２１６ｎｍ处单一负峰,是一种高β－折叠构象凝集素;近紫外ＣＤ谱呈现２８２ｎｍ处负峰和２６０～２７５ｎｍ及２９５ｎｍ处的负肩,经Ｎ－乙基顺丁烯二酰亚胺（ＮＥＭＩ）和对氯汞苯甲酸（ＰＣＭＢ）修饰ＭＤＬ的巯基,其近紫外ＣＤ谱未发生变化,远紫外ＣＤ谱仅发生细微变化,ＭＤＬ凝集活性保持不变;ＰＣＭＢ过量时,ＣＤ谱呈现典型的无规卷曲谱形,ＭＤＬ完全丧失凝集活性,去除ＰＣＭＢ后,活性又全部恢复．二硫苏糖醇（ＤＤＴ）修饰ＭＤＬ的二硫键并用碘乙酸（ＩＣＨ２ＣＯＯＨ）保护巯基,ＭＤＬ远紫外ＣＤ谱２１６ｎｍ处的负峰红移至２２５ｎｍ,且显著减小;同时,近紫外ＣＤ谱２８２ｎｍ处负峰几乎消失,两负肩分别保持完整,分子中α－螺旋降低,无规卷曲增加较多,ＭＤＬ凝集活性未发生变化．用Ｎ－溴代丁二酰亚胺（ＮＢＳ）修饰ＭＤＬ分子中的色氨酸,导致２１６ｎｍ负峰蓝移至２０８ｎｍ且变小,分子中无规卷曲和α－螺旋增加,β折叠减少,近紫外ＣＤ谱２９５ｎｍ负肩消失,２８２ｎｍ负峰红移至２８７ｎｍ,ＭＤＬ凝集活性完全丧失．     

岩豆凝集素的圆二色性与生物学活性关系的研究

岩豆凝集素（ＭＤＬ）的远紫外圆二色性谱（ＣＤ谱）显示２１６－２１７ｎｍ处的单一负峰。此时ＭＤＬ分子含有１６．２％的α螺旋,４６．３％的β折叠和３７．５％的无规卷曲。ｐＨ９．０时负峰红移至２２０ｎｍ,且在２１７－２２２ｎｍ处的峰值几乎相同;在２０－４０℃范围内,ＣＤ谱的变化甚微;６０℃时谱峰蓝移;在８０℃或１００℃时,２１２ｎｍ处出现一大负峰。１ｍｏｌ／Ｌ或２ｍｏｌ／Ｌ脲时,ＭＤＬ的ＣＤ谱已发生明显变化,二级结构单元也有变化,凝集兔红细胞的活性也随之减弱;随脲浓度的增加,ＭＤＬ的谱峰蓝移,最终在２１２ｎｍ处出现大负峰。当胍浓度为０．７５ｍｏｌ／Ｌ时,ＭＤＬ的ＣＤ谱即有明显变化和活性丧失;胍浓度继续增加,ＣＤ谱逐渐成为特征的无规卷曲的谱形。在ｐＨ９．０、温度超过８０℃、脲或胍浓度分别高于２ｍｏｌ／Ｌ和０．７５ｍｏｌ／Ｌ时,ＭＤＬ的ＣＤ谱发生显著变化的同时,其凝集兔红细胞的生物学活性全部丧失,分子的二级结构单元也发生很大改变。     

半夏蛋白在小鼠早期妊娠子宫结合部位的检测

利用辣根过氧化物酶标记定位技术对半夏蛋白抗小鼠早期妊娠的作用原理进行了探讨。结果显示小鼠子宫内膜和腺管上皮以及胚胎外胚盘锥体部分呈现明显的酶棕显色颗粒,它们的产生能被未经酶标半夏蛋白所抑制。子宫内膜和胚胎的其他部分均未见与半夏蛋白有专一性的结合。本文对半夏蛋白的抗生育机理进行了简略的讨论。     

岩豆凝集素的圆二色性与生物学活性关系的研究

岩豆凝集素（ＭＤＬ）的远紫外圆二色性谱（ＣＤ谱）显示２１６－２１７ｎｍ处的单一负峰。此时ＭＤＬ分子含有１６．２％的α螺旋,４６．３％的β折叠和３７．５％的无规卷曲。ｐＨ９．０时负峰红移至２２０ｎｍ,且在２１７－２２２ｎｍ处的峰值几乎相同;在２０－４０℃范围内,ＣＤ谱的变化甚微;６０℃时谱峰蓝移;在８０℃或１００℃时,２１２ｎｍ处出现一大负峰。１ｍｏｌ／Ｌ或２ｍｏｌ／Ｌ脲时,ＭＤＬ的ＣＤ谱已发生明显