Expression of a foreign gene by cysteine proteinase null recombinant baculovirus

Baculovirus expression vector systems (BEVSs) are broadly used for producing foreign proteins in lepidopteran cells. Most commercial BEVSs are engineered to insert foreign genes into the polyhedrin (polh) locus. They lack the polh gene. These viruses cannot produce occlusion bodies and are inconvenient for per os inoculation of larvae. To avoid this, expression cassettes can be inserted in other parts of the virus genome. The preS2-S gene, coding for the recombinant middle surface antigen of the human hepatitis B virus (M-HBsAg), was expressed from the baculovirus construct rBmNPV-Δv-cath-M-HBsAg, inserting the foreign gene into the v-cath locus of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) so that v-cath was deleted and native polh was retained. Silkworm larvae were infected per os and M-HBsAg was observed to be abundantly produced till very late stages of infection. Infection of larvae with a mixture of the recombinant and wild-type baculoviruses was followed by degradation of the bulk of the produced M-HBsAg as early as 96 h after inoculation.     

利用重组杆状病毒在家蚕中表达人血管内皮细胞生长因子

家蚕作为“生物工厂”生产重组蛋白质具有很多优势 .构建携带编码人血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 16 5个氨基酸的cDNA的重组杆状病毒 .将此重组病毒接种 5龄家蚕幼虫进行重组蛋白的表达生产 .时相表达分析表明 ,感染后大约 80h时表达水平达到最高 ,而且重组蛋白主要存在于血淋巴中 .从感染的幼虫收集血淋巴并用Nickle亲和层析纯化重组蛋白产物 .定量分析表明 ,每条家蚕幼虫的表达水平高达 4 2 6 μg左右 .通过细胞培养体外分析 ,发现与对照相比 ,加入纯化的重组VEGF(10ng ml和 10 0ng/ml)能够使人HUVEC细胞体外培养细胞数增加 1 8～ 3 3倍 ,说明家蚕幼虫表达的重组VEGF具有完全的生物活性 ,能够诱导内皮细胞在体外分裂增殖 .     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。     

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPO cDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPO DNA与野生型BmNPV DNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPO cDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～6.5d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Western blot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达

将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶 (AOX1)启动子下游 ,构建携带 8拷贝M表达盒的重组载体 ,经电穿孔转化SMD116 8菌株和G4 18筛选 ,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株 ,表达量超过 5 0mg L .经初步纯化 ,对表达产物的性质鉴定表明 ,重组蛋白具有preS2和S抗原性 ,可以形成颗粒 ,并具有一定程度的糖基化 .所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒 ,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料 .     

利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型（rAAV2）研究

腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统（AcMNPV-sf9）包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）。首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因和荧光素酶（luciferase,Luc）基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE（cytomegalovirus-IE,CMV-IE）启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上。随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）。再将纯化的重组病毒（reBm-Cap2、reBm-Rep2）与reBm-EGFP、reBm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒。利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否。结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达。     

家蚕细胞和虫体产生抗人小细胞肺癌抗体

用重组昆虫病毒表达系统,在家蚕细胞和虫体表达了抗人小细胞肺癌人-鼠嵌合抗体。重组病毒rNPVL2,rNPVH17及双重组病毒rNPVLH19感染的家蚕细胞和虫体血淋巴中都检测到抗体分子的表达。双重组病毒的双基因共表达部分产物可装配。ELISA分析表明抗体重轻链基因共表达产物具有比单基因表达产物高得多的与小细胞肺癌细胞免疫结合功能。     

昆虫保幼激素促进家蚕杆状病毒系统的基因表达

杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression VecterSvstem,BEVS)的一个最大优点是外源基因的高效表达(Hy-perexpression).但是,不同的外源基因在BEVS系统中的表达水平相差很大,较低的如α-干扰素,表达量为1～5mg/L培养细胞;高的如β-半乳糖苷酶,表达量可达600mg/L培养细胞.外源基因在BEVS系统中表达量受到诸多因素的影响,如细胞的类型与质量,外源基因蛋白的性质,启动子序列的完整性,是否为融合蛋白等[1].如何使外源基因在BEVS系统中高效表达,是近年来该领域中研究最活跃的方向之一.已证实家蚕杆状病毒的表达量受宿主遗传型的影响,最低和最高的遗传型相差达7倍以上[2].林水中等发现家蚕饲料中添食适当浓度的硫酸铜可提高外源基因单位表达量10%左右[3].杆状病毒在复制循环中表现出两种类型:芽生病毒和包涵体病毒,其中芽生病毒引起宿主体内不同组织间的感染,包涵体病毒则引起宿主之间感染[1].杆状病毒基因组中蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(egt)基因影响激素在宿主体内的平衡[4],egt基因通过糖基化作用使蜕皮激素失活,打破宿主体内的激素平衡,延长幼虫期,以利于病毒的增殖[5].家蚕血淋巴中保幼激素(Juvenile hormone,JH)的滴度同样决定着幼虫发育的进程[6],本文通过体表使用保幼激素,以研究保幼激素对家蚕核型多角体病毒和宿主之间的相互关系及对外源基因表达量的影响.     

Production of a Cellulase in Silkworm Larvae using a Recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus lacking the Virus-encoded Chitinase and Cathepsin Genes

The expression efficiency of an insect-derived cellulase was assayed in silkworm larvae infected with recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) mutants lacking the virus-encoded chitinase (chiA) and/or cathepsin (v-cath) genes. Expression was increased by approx. 10% in mutants lacking chiA or v-cath and 17% in a mutant lacking both chiA and v-cath compared with that of the unmodified recombinant BmNPV. The recombinant BmNPV lacking both chiA and v-cath can therefore be used for a large-scale production of foreign proteins in silkworms. Revisions requested 27 September 2005 and 16 December 2005; Revisions received 6 December 2005 and 3 February 2006     

间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的不同间臂(3C、8C和10C)和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性,从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果,分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下,CHO-HBsAg的收率可以接近100%,纯化倍数达到60。     

鸡贫血病毒VP1和VP1蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与CunI酶切线性化的亲本病毒Bm-Bacpak6DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCC－MSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒（Recombinant BmNP)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

人GDNF在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达

将人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经G418筛选得到多拷贝转化子,甲醇诱导表达。将人GDNF基因克隆入昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,与线性化Bm-BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经体内重组,筛选到重组病毒。用重组病毒感染家蚕幼虫,5d后收集血淋巴。SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了酵母培养上清液及家蚕幼虫血淋巴中含有GDNF蛋白。活性研究表明,甲醇酵母及家蚕幼虫表达的GDNF蛋白能促进多巴胺能神经元的存活和突起生长。     

人血管抑素（k1—3）在家蚕细胞和幼虫中的表达及活性测定

将人血管抑素 (angiostatin)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体 pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK angiostatin ,并与被线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK angiostatin。DNA点杂交结果表明重组病毒基因组中含有血管抑素基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞 (2×10 6个细胞 /瓶 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞 (ECV30 4 )及体内鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管实验检测其抑制活性 ,测得血管抑素可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖 ,家蚕细胞的产物活性在表达 72h达到最高值 ,在 2× 10 6个细胞中的表达量约 2 2u ;在家蚕体内表达 14 4h生物活性达到最高值 ,表达量约 15 9u/ml。2 .5u/ml的血管抑素能使ECV30 4细胞在 2 4h发生明显凋亡 ;可使CAM新生血管化率明显下降。此外 ,用ELISA、Western印迹方法测定了表达产物的免疫反应性。     

乙肝病毒s基因在家蚕细胞及蚕体内高效表达

把人乙型肝炎病毒(adr)的表面抗原S基因插入到家蚕核型多角体病毒基因组中,构建了重组病毒BmNPVS。用重组病毒感染家蚕细胞,测得每毫升培养物(1×10⁶细胞)HBsAg表达量达35．5μg;感染家蚕幼虫和蛹,经检测表明HBSAg产量平均为每头蚕约750μg,每只蛹约为690μg。初步纯化的表达产物经Westefn blotting和电镜观察证实,表达产物是直径为22nm的颗粒,并主要以糖基化形式存在。表达产物的浮力密度为1．2g／ml,与病人血清的HBsAg一致。     

gfp基因标记的重组杆状病毒对棉铃虫幼虫的侵染历程

 用携带杆状病毒极晚期多角体蛋白基因启动子驱动gfp表达的重组病毒rHa FGP感染棉铃虫三龄幼虫 .在感染后不同时间取样 ,分离不同组织 ,制片 ,置于倒置荧光显微镜下观察基因的表达 .结果发现 ,随着感染时间的推移 ,荧光产生的部位出现更替 ,随后荧光强度也发生相应的变化 .从荧光出现的先后初步推断出杆状病毒对昆虫幼虫的侵染路线 :中肠上皮→血淋巴→气管系统→脂肪体 真皮 .在幼虫感染后 12h荧光即出现于中肠细胞中 ,表明此时已有极晚期蛋白表达 .说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 (cry)表达 ,从而提高杆状病毒的杀虫毒力是可行的     

Silkworm, Bombyx mori larvae expressed the spider silk protein through a novel Bac-to-Bac/BmNPV baculovirus

Abstract:  The silkworm has become an ideal multicellular eukaryotic model system for basic research. The major advantages of expressing foreign genes in silkworm larvae are the low cost of feeding, the extremely high levels of expression achievable compared with expression in cell lines and increased safety because the baculovirus is noninfectious to vertebrates. In this study, we used a recently developed Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus (BmNPV) bacmid to express the spider flagelliform silk gene in silkworm larvae. The recombinant bacmid baculoviruses (rBacmid/BmNPV/Flag) were introduced into the first-day larvae of the fifth instar by subcutaneous injection. The worms presented symptoms typical of NPV infection from 72 h after injection compared with control. The haemolymph was collected from the infected larvae 120 h post-infection and the recombinant 6× His-tagged Flag protein was purified by the Ni-NTA spin kit under denaturing conditions with 8  m urea. A 37.0-kDa protein was visualized both in rBacmid/BmNPV/Flag-infected haemolymph and eluting fraction. The results showed that the Bac-to-Bac/BmNPV baculovirus expression system is an efficient tool to express the target gene in silkworm larvae, which takes only 7–10 days for generating recombinant baculovirus, compared with the traditional homologous recombination method, which needs at least 40 days for multiple rounds of purification and amplification of viruses.     

入源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒中和性基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区基因进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定.4株Fab抗体重链可变区拥有99%同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族.而轻链可变区核苷酸序列同源性为95%和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族.这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝单克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝病毒结构蛋白上的主要抗原决定簇.     

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体,在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多,其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域,文章就BmNPV的特性及其基因组构造,多角体蛋白基因的特性,重组BmNPV的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达,BmNPV-家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述.