puc启动子上游DNA二元对称序列突变对Rhodobacter sphaeroides氧调节的影响

为了鉴定ｐｕｃＢＡ基因表达受氧调控的顺式调节位点,通过ＰＣＲ和多聚核苷酸定点、突变的体外操作,在ｐｕｃ转录子５＇上游非编码区产生了７个不同突变和５个不同１０ｂＰ缺失序列。构建了含有各种顺式突变的ｐｕｃ上游区、ｐｕｃ启动子和报告基因ｌａｃＺ的转录融合子。通过融合子β－半乳糖苷酶活性分析,发现位于ｐｕｃ启动子上游二元对称结构的突变使得ｐｕｃ基因在有氧条件下去阻遏表达。ＩＨＦ束缚位点的突变可使β－半乳糖苷酶活性提高。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

hsp70与c—myc,c—fos和p50的结构及功能联系

热休克蛋白７０基因启动子部位有ｍｙｃ原癌基因产物的两个结构位点,分别位于ｈｓｐ７０基因５＇上游－１６０和－２３０碱基处,ｍｙｃ蛋白可以与其结合调节ｈｓｐ７０基因的转录活性,ｃ－ｆｏｓ基因启动与ｈｓｐ７０启动子区域存在着一种共同的反式作用因子结合区,可能受一种共同的特异性反式作用的调节,野生型Ｐ５３对ｈｓｐ７０启动子的抑制可能与ＣＣＡＡｂｏｘ结合因子有关;ｈｓｐ７０resume     

nisZ启动子结构与功能的研究

应用βGlucuronidase基因(gusA)作为报告基因,通过定点突变方法分别缺失nisZ编码区上游两个启动子结构(promoter1和promoter2)中的一个,发现只有靠近编码区的promoter2是nisZ启动子诱导表达所必需。将promoter2中10区及其上游的一个碱基突变为乳酸菌中典型的组成型启动子的10区结构,该改变使nisZ启动子诱导功能下降;将promoter2的10区和35区的间隔区由20个碱基缺失突变为17个碱基,则nisZ启动子失去诱导功能。据此认为该间隔区的结构与nisZ启动子的诱导表达密切相关。     

大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。     

水稻 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基 I 基因的启动子分析

水稻（Oryce sativa L．）基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基（ADP-Glucose pyrophosphorylase small subunit,OsAgpS）由两个基因编码,即OsAgpSl和OsAgpS2。其中OsAgpSl基因产生两个转录本OsAgpSla和OsAgpSlb,区别在第一个外显子的位置不同。通过RT—PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性。结果表明,两个启动子与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpSla转录本和OsAgpSla上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpSlb转录本和OsAgpSlb上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达。这说明OsAgpSl基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpSla上游启动子可以作为胚乳表达用启动子。     

水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基Ⅰ基因的启动子分析

水稻(Oryaz sativa L.)基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基(ADP-Glucose pyrophosphorylase smallsubunit,OsAgpS)由两个基因编码,即OsAgpS1和OsAgpS2.其中OsAgpS1基因产生两个转录本OsAgpS1a和OsAgpS1b,区别在第一个外显子的位置不同.通过RT-PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性.结果表明,两个启动了与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpS1a转录本和OsAgpS1a 上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpS1b转录本和OsAgpS1b上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达.这说明OsAgpS1基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpS1a上游启动了可以作为胚乳表达用启动子.     

大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)基因启动子及信号肽核苷酸顺序测定与解析

在pFOG405重组质粒中的大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)的启动子及信号肽区的核苷酸顺序被测定并同Kikuchi等人在pYK190重组质粒中所报道的顺序进行了比较。结果指出,包含有PhoA基因启动子及信号肽的PvuⅡ-HpaⅠ片段对于调控外源基因的表达是足够的;启动子5’-端的二元对称结构(26bp)的缺失并不影响外源基因的表达水平。由于pYK190及pFOG405中PhoA基因启动子的上游区核苷酸顺序的不同源性,说明此上游区顺序与PhoA启动子调控下的外源基因表达无关。这一分析为我们利用PvuⅡ-HpaⅡ片段组建高效分泌表达载体及研究基因表达调控提供了有用信息。     

空间飞行水稻pi-hit-1基因启动子功能分析

pi-hit-1基因是本实验室通过空间诱变找到的一个水稻新基因。为了对pi-hit-1基因启动子结构和功能进行研究,首先使用植物启动子分析数据库(PlantProm DB-TSSP,TFSEARCH,PLACE及PlantCARE)对该基因转录调控区序列进行预测分析,结果显示该基因上游调控区存在多个顺式元件,主要集中在翻译起始位点前300bp的区域,转录起始位点位于翻译起始位点前100bp,在转录起始位点前132bp存在TATA box元件。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)发现翻译起始位点上游约300bp存在转录因子特异结合位点,为该基因的核心启动子,这与预测结果一致。采用系统生物学的方法研究水稻新基因pi-hit-1启动子结构,发现了该基因的核心启动子元件,为研究空间环境如何影响基因的转录调控提供了重要依据。     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于?88~+156 bp,?88~?73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且?84~?63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

利用PCR技术行反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

设计一对ＰＣＲ引物,其中上游引物的５’端除目的基因外,还加Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列,以质粒（ｐＳＶＬＤ３）为模板,通过ＰＣＲ扩增出带有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列的１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该ｃＤＮＡ有２个碱基变异,以此ＰＣＲ产物为模板,通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其     

家蝇卵黄蛋白基因启动子区的克隆与活性分析

从家蝇基因组文库中分离到含约1．7kb5’上游区的家蝇卵黄蛋白-1基因组基因序列,根据其5’上游序列,PCR扩增出大小不同的4个启动子片段,分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游,构建了pMYP1-GFP、pMYP2-GFP、pMYP3-GFP和pMYP4-GFP4个重组质粒。另将 684／ 7、 1165／ 7这两个启动子片段用SpeⅠ和HindⅢ双酶切,去除包含CAAT／TATA盒的 302／ 7序列区后,分别构建了pMYP5-GFP和pMYP6-GFP两个重组质粒。通过电转移实验和荧光检测表明。 684／ 7、 1165／ 7、 1616／ 7这3个启动子片段具有转录活性,而 684／ 7启动子片段的转录活性最强, 296／ 7、 684／ 302、 1165／ 302这3个启动子片段无转录活性。上述实验结果表明。 302／ 7序列区为启动子的核心部分。 302到 1616之间存在调控性启动子或增强子等其他一些顺式元件。细胞转染实验证实,6种启动子片段在BHK-21和Sf9细胞中都未表现出可检测的转录活性,说明家蝇卵黄蛋白基因启动子具有组织或细胞特异性。     

增强子作用机制研究进展

增强子是能够增强启动子转录活性的ＤＮＡ顺式作用序列。增强子的结构与启动子相似,也是由多个元件组成,每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。增强子可以在启动子区的上游或下游起增强转录作用且与其距转录起点的远近无关。如Ｔ细胞受体α链基因的增强子位于启动...     

人分裂细胞核抗原基因片段的筛选、测序及对启动子的分析

经６．６×１０５个克隆筛选,从装在λ噬菌体载体Ｃｈａｒｏｎ３０中的人基因库中筛选到了一个含人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因的克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析插入基因长约１４ｋｂ,有较长的５＇上游区,但３＇端缺少一部分。经亚克隆和测序已确定从５＇上游１２６３ｂｐ到３＇端与λ载体接点共４９６９ｂｐＰＣＮＡ基因片段的核苷酸序列。将ＰＣＮＡ基因启动子核苷酸序列与ＤＮＡ聚合酶α,拓扑异构酶Ⅱα,胸苷酸激酶基因的启动子进行比较有３０％以上同源性,具有“看家基因”特征。在转录起始点的５＇上游几百ｂｐ的范围内都有与ＣＡＴ,ＳＰ１,Ｅ２Ｆ,ＮＦＨＢ,Ｏｃｔ１和ＡＴＦ等转录因子的结合位点相似的核苷酸序列。     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于-88~+156 bp,-88~-73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且-84~-63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮 螺菌nifH启动子的转录激 作用

用ＰＣＲ方法克隆了巴西固氮螺菌Ｙｕ６２ｎｉｆＨ的启动子片段,ＤＮＡ序列分析表明菌株Ｙｕ６２与标准菌株Ｓｐ７之间的ＤＮＡ序列差异很小。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２,构建了３个不同的ｎｉｆＨ１ａｃＺ转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ启动子的转录是依赖于ＮｉｆＡ的,缺失了上游激活序列的启动子不能被ＮｉｆＡ激活转录,肺炎克氏杆菌Ｎ     

棘孢木霉木聚糖酶Ⅰ基因和启动子克隆与分析

目的:克隆及分析棘孢木霉木聚糖酶Ⅰ结构基因和上游调控区,以获得内源启动子.方法:根据木霉属木聚糖酶Ⅰ结构基因及上游调控区的保守性,以棘孢木霉基因组DNA为模板,进行简并PCR扩增.产物纯化并克隆至T载体,经酶切鉴定后讲行序列分析.结果:扩增获得1.2 kb的片段,酶切鉴定及序列分析表明,该片段长1 265 bp,由753 bp的木聚糖酶Ⅰ结构基因和512 bp的上游调控区组成.结构基因编码230个氨基酸,具有糖基水解酶第11家族的典型保守区域.上游调控区具备核心启动子和转录起始点,有CAAT-Box、TATA-Box等启动子特征元件,分析其还有Cre Ⅰ、XlnR、Acel、AreA等多个转录因子结合位点.结论:克隆的512 bp上游调控区是典型的丝状真菌基因启动子,可作为内源启动子用于构建棘孢木霉高效外源基因表达系统.