广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT—PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的PCR引物,采用双重RT—PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49．7％)检出CyMV,52份(34．0％)检出ORSV,2份(1．3％)同时检出CyMV和ORSV。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物.CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp.以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源.因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV.混合上述两种病毒的 PCR引物,采用双重RT-PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49.7%)检出CyMV,52份(34.0%)检出ORSV,2份(1.3%)同时检出CyMV和ORSV.     

三种食源性致病菌的多重PCR快速检测及应用

针对常见的3种食源性致病菌肠出血性大肠杆菌O157H7的rfbE基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因及沙门氏菌的hilA基因,使用Primer 5.0软件设计出相对应的特异性引物,预计PCR产物的分子大小为287、354及468 bp。通过单一、双重及三重PCR对样品进行检测,并对人工感染的鲜奶进行检测。结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均能成功扩增出与预计大小一致的片段,无非特异性扩增。人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定。这说明此3对引物可分别用于3个菌靶基因的PCR检测。     

PCR技术在检测鼠金黄色葡萄球菌中的应用研究

目的　建立实验大小鼠金黄色葡萄球菌的快速检测方法———PCR法。方法　根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果　金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性 ,结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。结论　本研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测。     

伪品乌梢蛇PCR鉴别和蛇种溯源调查

目的利用基因序列同源性分析的方法对伪品乌梢蛇蛇种溯源调查。方法 (1)用PCR的方法对供试品进行鉴别;(2)利用通用引物扩增乌梢蛇对照药材和供试品COⅠ基因,将PCR产物进行测序,测序结果在NCBI进行BLAST序列同源性比对分析。结果 (1)在与对照药材凝胶电泳图谱300～400 bp处,无DNA条带,200～300 bp处有DNA条带;(2)基因序列同源性比对结果显示,对照药材为乌梢蛇,两个供试品均为灰鼠蛇。结论用PCR方法鉴别乌梢蛇是一种准确、客观的方法。利用COⅠ基因通用引物扩增的PCR产物进行测序和序列同源性比对,可以对蛇种进行溯源调查。     

大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

马铃薯多酚氧化酶基因克隆及反义表达载体构建

从甘农薯1号马铃薯试管苗叶片中提取总DNA,根据Genebank报道的马铃薯多酚氧化酶基因(PPT32)序列,设计合成了带有BamHⅠ、SacⅠ特定酶切位点的2对特异引物,通过PCR获得l840bP和476bP的扩增产物。测序结果表明,l840bp的扩增产物与Oenebank中发表的序列一致,476bp的扩增产物正是欲扩增的马铃薯多酚氧化酶基因的同源片段。将2个扩增产物反向连接到表达载体PC3中,通过双酶切鉴定后,按直接导入法实现反义基因表达载体质粒向农杆菌EHA105的导人;并经PCR鉴定证明,此质粒已整合到农杆菌Ti上。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。     

间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的作用初探

目的:初步研究利用C3Spacer间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的影响及作用。方法:选取1个常用短串联重复序列(STR)位点,利用间隔子修饰该位点荧光标记引物,以DNA标准物质为模板进行PCR扩增,记录相应扩增产物DNA片段长度,进行修饰与长度变化的相关性分析。结果:选取STR位点D13S317,分别利用TTTTC3SpacerC3Spacer、TTTTC3Spacer、TTTT修饰R0X标记引物,相应扩增产物长度为182.67±0.05、182.19±0.11和181.6±0.19bp,未进行修饰的对照组引物扩增产物长度为177.09±0.15 bp,产物DNA片段长度随不同修饰基团的修饰发生规律性变化。结论:发现了一种修饰基团,用该基团修饰引物后,可在体外通过PCR反应改变扩增产物等位基因片段的大小,从而在不改变特异性引物信息的前提下使产物发生规律性位移,修饰基团与DNA片段大小呈内在相关性。     

马铃薯S病毒RT-PCR检测技术的研究

从感染PVS病毒的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA,进行反转录cDNA的合成,用特异性引物进行PCR扩增,得到一条长度约为199 bp的特异性PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVS的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法,为PVS的防治提供了有效手段。     

基于多重PCR的DNA Marker制备方法

报道了一种简便的制备分子量大小为100-1000bp DNA marker的方法,其原理是以一段特异的DNA片段为模板,设计PCR引物,采用多重PCR的方法一次扩增100-1000bp系列条带,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,即可得到条带清晰的DNA marker。     

三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素*

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对 ,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对 ,应用三重RT PCR同步检测马铃薯X病毒 ,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒 ,分别得到 5 62bp、 2 5 5bp、 1 82bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件 3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT PCR同步检测 3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、 3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大 ;其次是PCR反应中MgCl₂ 浓度和退火温度 ;     

聚合酶链反应鉴定马肉方法的建立及应用

依据马卫星DNA序列设计了1对引物,建立了PCR鉴定生、熟马肉的方法。引物Ⅰ 5′-GTTGTGCCTTTCAGCTCTAGG-3′,合成浓度2.64μg/μl;引物Ⅱ 5′-ACAGCATCTTG-CATCCAGC-3′,合成浓度2.97μg/μl,设计扩增长度为186bp。PCR扩增体系为50μl,循环参数为94℃ 40s、49.5℃ 50s、72℃ 60s,35个循环后72℃保温延伸7min,产物经3％琼脂糖凝胶电泳鉴定。应用本方法可以从生鲜马肉、煮熟马肉、高压马肉的全基因组DNA中扩增出186 bp的目的DNA条带,而对牛、羊、猪、驼、鹿等15种动物的DNA扩增则呈阴性反应。其     

12S rRNA和Cyt b基因序列测定在獐乳制品鉴定中的应用

采用改良的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法从脂肪含量很高的动物乳制品及胃组织中提取出基因组总DNA,利用特异引物扩增了线粒体12S rRNA基因和Cyt b基因的部分片段,测定了12S rRNA和Cyt b基因的PCR扩增产物序列,使用BLAST搜索软件将其序列与GenBank中的同源序列进行比对,并利用DNAMAN分析软件分析序列同源性。结果表明3件检材均来源于獐Hydropotes inermis。本研究所用方法在野生动物乳制品鉴定中具有较高的应用价值。     

RT—PCR方法扩增白蛉热病毒M片段的研究

为建立扩增未知序列白蛉热病毒M片段的RT—PCR方法,本研究选取7个血清组成员和8个未分组血清型,共42株白蛉热病毒为RT—PCR检测对象。通过排列GenBank中已知的4型白蛉热病毒M片段氨基酸序列,选择保守区设计引物。根据保守区各已知病毒的cDNA特异序列合成寡核苷酸,将相同区的寡核苷酸等量混合成为“鸡尾酒”引物,用于RT—PCR。扩增产物经电泳检测,纯化后直接测序。引物对Ph—M—2FM和Ph—M—3RM扩增产物长度约为600bp,从42株病毒中扩增出34株,阳性率为81．0％。另一引物对Ph—M—2FM和Ph—M—4R2M扩增产物长度约为1400bp,扩增出22株病毒,阳性率为52．3％。测出序列经BLAST检索,与GenBank中已知白蛉热病毒同源。本研究首次成功地应用RT—PCR扩增不同血清型未知序列白蛉热病毒的部分M片段,并测出扩增产物序列,为白蛉热病毒属成员的基因鉴定和种系发生关系分析提供了实验手段,并将有助于白蛉热病毒感染的基因诊断。     

16S rRNA PCR鉴定脆弱类杆菌

目的:应用16SrRNA序列设计PCR引物鉴别脆弱类杆菌。方法:通过脆弱类杆菌16SrRNA序列特异性位点设计引物,对4株脆弱类杆菌及大肠杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌等进行PCR扩增。应用琼脂糖电泳法对PCR扩增产物进行特异性检测。结果:脆弱类杆菌在176bp左右出现特异性条带,而其他细菌均未出现特异性条带。结论:通过16SrRNA序列中特异位点设计引物进行PCR,可特异性鉴定脆弱类杆菌。     

白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因开放读框的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框中编码^1MSSVKY^6的序列和编码^492NEIVR^496的序列分别设计上,下游引物,以白念珠菌ATCC11006的基因组DNA为模板进行PCR扩增;将PCR产物克隆并做序列分析后,在大肠杆菌中进行表达。结果PCR获得大小约为1.5kb的产物,测序分析表明克隆的产物大小为1491bp。正是白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,表达得到约为80kDa大小的蛋白,与理论计算一致。本研究为开展特比萘芬与其作用靶酶关系的研究奠定了基础。