一种经济、简便的双向电泳方法

双向电泳是蛋白质分析的一门较为精确的技术.对电泳方法进行改良并采用普通垂直薄板等电聚焦技术,不仅大大降低了蛋白质双向电泳的成本,而且操作过程简单,是一种用于初步分析蛋白质的较好方法.在中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)雌雄成虫可溶性差异蛋白的分析中获得了较满意的结果.这一改良方法的建立,可望促进双向电泳的广泛应用.     

RNA沉默手段分析烟草悬浮细胞中线粒体分裂蛋白NtFIS1A/1B功能

为了解烟草悬浮细胞中的线粒体分裂蛋白的功能,将拟南芥(Arabidopsis thaliana)的线粒体分裂复合体成员FIS1A和FIS1B在烟草(Nicotiana tabacum)表达序列数据库中进行序列比对,鉴定到烟草中的同源基因NtFIS1A 和NtFIS1B (NtFIS1A/1B).以烟草悬浮细胞为材料,通过RNA 干扰和人工microRNA 干扰技术抑制NtFIS1A/1B 的表达, RT-PCR 分析结果表明,RNA 沉默细胞系中NtFIS1A/1B 的转录受到抑制.观察RNA 沉默细胞系中的线粒体形态可见,当NtFIS1A/1B 的表达被抑制后,单个线粒体的平均面积显著增加.这些表明NtFIS1A/1B 参与了烟草悬浮细胞中线粒体分裂的调控,有助于了解烟草中线粒体的形态调控.     

时钟基因Rev-erbα在运动诱导线粒体生物合成中的作用及可能机制

线粒体生物合成是细胞适应能量需求、维持能量稳态的重要手段,其过程受到生物钟系统的全局调控。作为机体的能量供应站点,线粒体生物合成障碍与各种疾病的发生发展密切相关。时钟基因Rev-erbα能整合昼夜节律与能量代谢,在调节线粒体生物合成过程中起到了重要作用。运动作为一种行之有效的改善健康、促进恢复的非药用方式,不仅能促进线粒体生物合成增强,还与Rev-erbα存在着双向调节,因此考虑Rev-erbα可能是运动诱导线粒体生物合成的中介物质。本文就Rev-erbα在调节线粒体生物合成中的作用、影响Rev-erbα的可能因素、运动与Rev-erbα的相互作用及运动通过Rev-erbα诱导线粒体生物合成的潜在机制进行了梳理和探讨,以期为运动促进线粒体生物合成机制提供理论参考。     

利用酿酒酵母转座子文库筛选线粒体镁代谢相关基因

镁离子对于维持细胞正常功能十分重要,糖尿病、高血压、慢性呼吸道疾病、骨质疏松、心律失常等多种疾病都与镁代谢失衡有关．MRS2 基因编码线粒体镁离子转运蛋白,MRS2缺失会导致酵母线粒体镁离子浓度下降、线粒体内Ⅱ型内含子剪接缺陷和非发酵碳源培养基上的生长缺陷．为了增进对线粒体镁离子代谢调控基因的了解,利用酿酒酵母mTn-lacZ/LEU2转座子文库筛选MRS2的抑制基因,发现线粒体载体家族成员YMR166C基因的缺失可以挽救MRS2基因缺失突变体的生长缺陷、Ⅱ型内含子剪接缺陷,并可以调节线粒体镁离子浓度,首次发现YMR166C是线粒体镁代谢相关基因.     

肺囊康定产生菌Glarea lozoyensis线粒体基因组序列的再分析

[目的] Glarea lozoyensis是抗真菌药物卡泊芬净的产生菌,其突变菌株ATCC 74030的线粒体基因组已被报道。我们此前的研究发现诱变剂能引起该菌某些细胞核基因的突变,但诱变剂是否也能引起线粒体DNA序列的改变并不清楚。[方法] 组装野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,并与发表的突变型菌株ATCC 74030的线粒体基因组进行比较。通过PCR验证野生和突变菌株线粒体基因组间表现差异之处,并利用正确的线粒体基因组序列进行新的分析。[结果] 我们成功组装出野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,通过比较其与发表的ATCC 74030的线粒体基因组序列,发现存在6处单核苷酸变异位点和2处具有长度差异的区域。然而,随后的PCR验证和序列比较并没有发现2个菌株间存在这些差异。最初观察到的碱基差异是因为发表的ATCC 74030线粒体基因组存在序列错误。有趣的是,在Glarea lozoyensis的线粒体基因组中,我们发现存在3个具有内含子的tRNA基因和1个rnpB基因。同时,该菌线粒体基因组中存在多种重复序列,在其线粒体和细胞核基因组间也存在明显的DNA片段重复事件。[结论] 诱变剂没有引起G. lozoyensis线粒体DNA的任何改变;发表的ATCC 74030的线粒体基因组存在序列错误。我们报道G. lozoyensis正确的线粒体基因组序列,并且发现该菌线粒体和细胞核基因组间频繁的基因交流。     

线粒体自噬基因对酿酒酵母抗氧化性能的影响

线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程,对维持细胞内稳态具有重要作用。为探究线粒体自噬基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞抗氧化性能的影响,本研究分别构建了线粒体自噬相关基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失和过表达菌株,发现在过氧化氢(H₂O₂)胁迫6 h后,过表达ATG8、ATG11基因显著降低了细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分别仅为初始状态的61.23%和46.35%,并显著提高了菌株线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)含量,有助于提高菌株的抗氧化性能。另一方面,基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失会导致线粒体损伤及细胞活力显著下降,同时造成胞内ROS失衡,H₂O₂胁迫6 h后,其胞内ROS含量显著升高至初始状态的174.27%、128.68%和200.92%。结果表明,ATG8、ATG11和ATG32可能是调控酵母抗氧化能力的潜在靶点。本研究为进一步研究通过调节线粒体自噬提高酵母抗氧化活性提供了新的线索。     

内毒素休克大鼠肝线粒体质子跨膜转运的改变

用稳态荧光探针标记技术动态观察内毒素休克大鼠肝亚线粒体质子跨膜转运的变化.发现,休克5 h ATP、NADH和琥珀酸钠所致的9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA）最大荧光淬灭值（ΔA_max）显著低于对照组(P＜0.05)、最大荧光淬灭时间（T_ΔAmax）、半数荧光淬灭时间（T_1/2ΔAmax）非常显著延长(P＜0.01),肝线粒体质子跨膜转运能力下降;膜脂分子烃链和膜脂深层次流动性下降;线粒体膜PLA₂活性增加;血浆脂质过氧化产物MDA和线粒体MDA含量均显著增加.可能膜脂质过氧化和磷脂酶A₂的水解是引起内毒素休克肝线粒体质子转运功能改变的重要因素.     

蛋白和酯酶电泳在根霉鉴定上的应用

对根霉(Rhizopus)属的十个种或变种共二十四株菌的菌体可溶性蛋白和酯酶同工酶进行了电泳的研究得到对这个属分类上更多的依据.在严格控制培养,提取和电泳条件的情况下,同一株菌不同批次所得菌体蛋白电泳图谱有较好的重复性.在相同的条件下,每个种的根霉有各自特征性蛋白图谱,种内不同菌株的蛋白图谱和酯酶酶谱基本相同.特别是形态特征明显、分类地位明确的种,种内各株的图谱也较一致,如R. stolonifer;与R.circinans.在确定新变种R. delemar var. latoapicalis时,电泳图谱与R.delemar var.delema:有明显不同,起到了佐证作用.因此认为,蛋白图谱与酯酶酶谱相辅相成,在根霉种的分类中是一有效的辅助手段.     

红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体atp6基因转录本的编辑位点研究

以红莲（HL）型水稻细胞质雄性不育系A、保持系B及杂种一代F₁为材料,首次比较研究了红莲型水稻线粒体atp6基因转录本的编辑位点及各位点的编辑频率.结果表明atp6基因的转录本有18个编辑位点,其中有15个发生在密码子的第一和第二位点上,这些位点的编辑最终会导致氨基酸种类的变化.18个编辑位点在A、B和F₁中没有差异,但各位点的编辑频率在引入了核恢复基因的条件下发生了较大的变化,完全编辑的比例增加.这些结果首次证明HL型细胞质雄性不育与线粒体atp6转录本的编辑有一定相关性,编辑不充分的转录产物最终会干扰线粒体功能的正常发挥.     

丹参SmVS基因的克隆和表达分析

为了解丹参(Salvia miltiorrhiza)的Vinorine合成酶基因(VS)的功能,从丹参中克隆了SmVS基因,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用RT-qPCR技术分析其表达模式。结果表明,SmVS基因全长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白分子量为26 861.72,等电点PI为5.66,为膜外蛋白,推测定位于线粒体。系统进化分析表明,丹参SmVS与野生油橄榄(Olea europaea var. sylvestris)的VS亲缘关系较近。SmVS基因在丹参根中的表达比叶的高,叶中的转录水平在21:00最高。因此,推测SmVS基因与光应答有关。     

一种快速简便的提取和纯化蓖麻毒素的方法

蓖麻毒素是免疫毒素的重要组成之一。本文采用硫酸胺盐析法,从蓖麻籽匀浆液中直接制备粗毒。然后,在酸化Sepharose 4B柱上用半乳糖溶液梯度洗脱。由此得到分子量为65000道尔顿的电泳纯蓖麻毒素。其小鼠LD₅₀为0.53μg,M olt-4细胞毒性试验IC为3.8×10^-10M与以前报道用改良Olsnes法所得结果相近。但操作简便、得率提高近5倍。     

全自动生化分析仪测定血清AST同工酶

应用天冬氨酸氨基转移酶抑制剂“AMANO-3”水解样品中的线粒体型天冬氨酸氨基转移酶同工酶（m-AST）,测定血清中剩余的胞浆型AST同工酶（c-AST）活性,进而与总AST活性相比较并计算出受抑制剂水解的m-AST同工酶活性．由于此方法采用蛋白水解反应破坏m-AST,因此测定方法可直接应用于生化自动分析仪．亦建立了一个适于日立7150分析仪的AST同工酶联合测定方法．其测定和计算出的m-AST同工酶批内CV为3.5％～7.9％;其结果(y)与AST同工酶电泳迁移率(x)相关．y=1.019x-0.489,r＝0.996（n＝30）．测定了113名健康人m-AST和c-AST,其m-AST参考值范围1.64～9.64U/L,x±s＝(5.641±2.013)U/L;c-AST参考值范围5.69～16.81U/L,x±s＝(5.641±2.013)U/L．     

德巴利汉逊酵母的两个变种及其相关种的脉冲电泳核型比较分析

摘要:用CHEF(钳位均匀电场)脉冲电泳系统分析了德巴利汉逊酵母的两个变种及两个相关种的脉冲电泳核型。对每个分类群的染色体条数,染色体DNA的分子量大小范围及整个基因组大小作出了估算,结果如下:Debaryomyces hansenii(Zopf) Lodder et Kreger-van Rij var. hansenii具有6-7条染色体,分子量范围为1.2-2.6(个别3.5)Mb,整个基因组大小为I 0.6-14.9Mb;D. hansenii var. fabryi (Ota) Nakase et Suzuki具有7条染色体,分子量范围为0.7-2.4M b,整个基因组大小为12.0-12.7Mb;D. nepalensis Goto et Sugiyama具有6-8条染色体,分子量范围为(个别0.2)1.1-2.7Mb,整个基因组大小为10.6-11.0Mb;Candida saitoana Nakase et Suzuki具有10-11条染色体,分子量范围为0.6-3.6Mb,整个基因组大小为18.1-18.9Mb.本研究表明C. saitoana与上述德巴利酵母属的三个分类群在脉冲电泳核型上具有明显差异,而后三者之间在染色体DNA带型上却没有发现有价值的区别之处.     

人线粒体tRNALeu（UUR）基因氧化损伤与修复研究

人mtDNA比核DNA更易受到自由基的氧化损伤,这些损伤可以被线粒体内的DNA修复机制所修复,损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素.为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtDNA突变的具体影响,采用四氧嘧啶处理LO₂细胞,这种试剂进入细胞后,经氧化还原反应生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似,然后观察自由基对细胞mtDNA的氧化损伤与损伤后DNA修复的动力学变化.由于线粒体的正常功能为修复机制所必需,采用MTT细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力,发现9 mmol/L四氧嘧啶培养细胞1h后,线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后0,2,8和24 h时间点均无明显变化.提取各组细胞的mtDNA,用EndoⅢ和Fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸,然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtDNA,进行DNA印迹实验,地高辛-抗体-碱性磷酸酶系统显色,检测完整与断裂的mtDNA量,利用Poisson公式（s=－lnP₀/P,P₀为未断裂链光密度值,P为所有链光密度值总和）计算一个mtDNA分子的平均损伤频率,结果显示,9 mmol/L四氧嘧啶处理细胞1 h,链平均损伤频率由对照的0.11个/分子增加至5.60个/分子,明显增加了mtDNA上核苷酸的氧化损伤,除去药物后8 h,绝大部分损伤可被修复,损伤频率减至0.40个/分子,除去药物后24 h核苷酸的氧化损伤恢复至正常水平.采用接头介导PCR（LM-PCR）检测MTTL1基因区域内单个核苷酸的损伤与修复动力学.这种方法可以检测各组mtDNA上MTTL1基因75 bp区域内单个核苷酸损伤的部位及频率.结果显示,人MTTL1基因存在20个易受氧化损伤的核苷酸热点,经与相应区域内文献报道的16个突变热点比较,有12个热点部位重合,而修复未显示热点部位或区域.结果提示,自由基对核苷酸的选择性氧化损伤是决定mtDNA点突变发生及发生部位的主要原因.     

草菇热激蛋白60基因(Vvhsp60)生物信息学分析及低温下的表达

【背景】生物受到温度胁迫时,热激蛋白被诱导并在短时间内大量产生,可以使受损的蛋白质恢复正常构象,增强生物对逆境胁迫的耐受性。【目的】初步探究草菇热激蛋白60(Vvhsp60)与低温耐受性的关系,为深入开展草菇不耐低温特性的遗传改良奠定理论基础。【方法】对Vvhsp60进行生物信息学分析,以低温敏感型草菇菌株V23及耐低温菌株VH3为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术分析低温胁迫及热激诱导后在低温下草菇菌丝体中Vvhsp60基因的表达水平。【结果】草菇Vvhsp60编码蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白,在线粒体和细胞质内发挥生物学作用,属于双向跨膜蛋白。低温处理显著提高了V23与VH3菌丝体中Vvhsp60基因的表达量,而且VH3中的表达量显著高于V23,推测Vvhsp60基因的表达量高可能有助于增强草菇对低温胁迫的耐受性。经热激处理后两菌株Vvhsp60基因的表达量显著高于各自未热激处理的对照组,表明热激处理可诱导Vvhsp60基因的表达。【结论】Vvhsp60与草菇低温耐受性相关,并且热激可以诱导Vvhsp60基因的表达。     

高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究

藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了SephadexG-200、DEAE-SephadexA-25、HA、SephadexG-200的分离纯化程序。此法效果理想：PAGE显示为单条电泳带;纯度值(A₆₁₅／A₂₈₀)高达14,突破了国内外报告的最高值.     

低温处理对异育银鲫腹部脂肪组织能量代谢相关基因表达的影响

本文以异育银鲫为研究对象,将其在4 ℃水温条件下暂养12 h,研究其脂肪组织在低温环境下的基因表达变化。HE染色切片和透射电镜拍照结果显示,并未观察到由低温处理导致的组织学显著变化,如明显的线粒体结构增多现象。利用Western blot分析手段,检测了常温和低温处理异育银鲫腹部脂肪组织中的线粒体蛋白分子COX IV的表达水平,发现经过低温处理,异育银鲫脂肪组织中的线粒体蛋白COXIV略有增加。荧光定量PCR的结果显示,在低温环境下,异育银鲫腹部脂肪组织中的Cell Death Inducing DFFA Like Effector A（cidea）, Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha（pgc1）, Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma（pparg）, Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta（ppargca1）, uncoupling protein 1（ucp1）, uncoupling protein 2（ucp2）和uncoupling protein 3（ucp3）等基因的转录表达均出现了显著上调。这是首次证实鱼类腹部脂肪组织中的UCP分子均可以被低温诱导上调表达。     

基于线粒体COⅠ基因的三江源草原毛虫金小蜂分子鉴定与系统发育分析

【目的】三江源草原毛虫金小蜂在形态学水平上已被鉴定为草原毛虫蛹期的寄生蜂新种。本研究拟从分子标记水平再次对三江源草原毛虫金小蜂进行物种辅助鉴定,探究其在小蜂总科中的系统发育关系。【方法】利用分子生物学手段对三江源草原毛虫金小蜂线粒体COⅠ基因进行扩增、测序与分析,并采用邻接法构建系统发育N-J树。【结果】三江源草原毛虫金小蜂线粒体COⅠ基因校正后的长度为812 bp,A、T、C、G碱基含量分别为34.36%、42.61%、10.59%、12.44%,AT含量显著高于GC含量,具有明显的AT偏好性;三江源草原毛虫金小蜂与蝶蛹金小蜂COⅠ基因相似度最高,遗传距离最小,表明三江源草原毛虫金小蜂与蝶蛹金小蜂亲缘较近,因此推断三江源草原毛虫金小蜂可能属于金小蜂科物种;三江源草原毛虫金小蜂先后与Eupelmus sp.、Sycoscapter sp.、Idiomacromerus sp.、Diaziella bizarre、Eurytoma sp. 聚为一支,且与 Idiomacromerus sp.+(Diaziella bizarre+Eurytoma sp.)+(Eupelmus sp.+Sycoscapter sp.)形成姊妹群。【结论】本研究从分子标记水平揭示了三江源草原毛虫金小蜂与金小蜂科物种的亲缘关系较近,支持了三江源草原毛虫金小蜂的形态学物种鉴定结果,为更深入地研究三江源草原毛虫金小蜂系统发育提供了科学依据,对草原毛虫的生物防治具有重要意义。     

三种植物线粒体基因低温差异表达比较分析

线粒体作为植物细胞的能量代谢中心,在植物响应逆境胁迫中有重要的作用。该研究基于雪莲(Saussurea involucrata)、番茄(Lycopersicon esculentum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)三种不同低温耐受性植物的低温转录组。通过blast比对和数据库检索筛选相关物种的线粒体基因,使用PlantCARE在线网站分析启动子,使用mega7软件对系统发育树构建分析。结果表明:通过差异表达基因筛选,分别在雪莲、拟南芥、番茄中筛选出2、24、15个显著差异表达基因,主要包括线粒体核糖体亚基和电子传递链各复合体亚基,其中部分基因的低温差异表达情况如NAD1和NAD5,可能与植物的低温适应性有关; 通过表达模式的聚类分析,雪莲与拟南芥在基因的表达模式上相对于番茄更为相近,且不同类别的基因表达模式在不同物种间差异较大; 雪莲与其他菊科植物的呼吸链相关基因的蛋白序列具有很大差异,与万年藓(Climacium dendroides)、牛舌藓(Anomodon minor)等高山植物的进化距离较近。在整体上拟南芥、番茄和雪莲三种植物线粒体基因在低温响应上具有很大差异,表明线粒体基因及其表达调控与植物的低温耐受性之间存在一定的关联性。     

中枢神经蛋白质组分析中双向电泳技术的建立

建立和优化了中枢神经组织蛋白质组分析所需的双向电泳及相关技术.由于中枢神经组织结构的特殊性,样品处理非常困难.对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法和保存等相关技术进行了比较研究和条件优化后,以固相pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶（T=12.5%）的水平电泳为第二向,成功地得到了神经组织双向电泳图谱.