ODC,AdoMetDC双反义腺病毒对肺癌增殖和侵袭制作用的体外和体内研究

鸟氨酸脱羧酶(ODC)和S-甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)是多胺体内合成的2个关键酶.研究腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas介导的ODC和AdoMetDC反义RNA对肺癌多胺合成,细胞增殖以及侵袭的抑制作用.用活细胞计数和流式细胞术分别检测Ad-ODCas和Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞增殖的影响,蛋白质印迹和HPLC方法分别检测腺病毒对肺癌A-549细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞凋亡的影响,Matrigel侵袭实验分析腺病毒对肺癌A-549细胞侵袭活性的改变,裸鼠皮下移植瘤模型研究Ad-ODC-AdoMetDCas对体内肺癌生长的抑制作用.实验结果显示,Ad-ODC-AdoMetDCas明显抑制肺癌A-549细胞的增殖,导致细胞凋亡,显著降低肺癌A-549细胞的体外侵袭能力,肺癌A-549细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞内3种多胺含量都明显降低,Ad-ODC-AdoMetDCas对已形成的裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用.实验表明,ODC和AdoMetDC双反义腺病毒具有显著抑制肺癌增殖和侵袭的作用,对于肺癌的防治研究具有一定的前景.     

ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体对食管癌细胞凋亡影响的研究

为探讨ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响,应用MTT法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响,采用Western blot和HPLC的方法分别检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,同时应用原位末端标记(TUNEL) 法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响, 透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变． 实验结果显示,应用MTT法观察发现Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用． 以Ad-ODC- AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达． HPLC结果显示,食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内3种多胺含量都明显降低． TUNEL标记检测结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡．透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征(表现细胞体积缩小,核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集等)． 实验表明,ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)具有显著抑制食管癌细胞生长增殖,降低细胞多胺合成,促进细胞凋亡,为探讨食管癌基因治疗的可行性提供实验依据．     

鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对前列腺癌细胞生长的抑制作用

为研究鸟氨酸脱羧酶 (ODC)基因反义RNA对前列腺癌细胞的生长抑制作用 ,将表达ODC第 3外显子反义RNA的重组腺病毒rAd ODC Ex3as分别感染前列腺癌细胞株PC 3和LNCap .通过MTT法观察其对前列腺癌细胞增殖的影响 ,并确定不同细胞合适的感染滴度 ,再采用Western印迹和流式细胞术检测rAd ODC Ex3as对细胞中ODC表达的抑制作用、对细胞周期和凋亡的影响以及与CDK抑制物p2 1的关系 .实验显示 ,rAd ODC Ex3as分别以 5 0MOI、2 5MOI感染PC 3和LNCap细胞可明显抑制其生长增殖 ,而不引起细胞毒性作用 ;其对两种细胞中ODC表达的抑制作用分别为4 5 %和 5 9% .流式细胞DNA含量分析证实 ,rAd ODC Ex3as可引起PC 3和LNCap细胞周期G1期阻滞 ,但并未引起凋亡 .通过Western印迹发现 ,细胞中ODC表达的降低可诱导p2 1蛋白的过表达 .结果表明 ,rAd ODC Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达 ,并通过诱导p2 1的过表达使其细胞周期停于G1期 ,从而抑制前列腺癌细胞PC 3和LNCap的增殖 ,为其进一步基因治疗的研究打下基础 .     

重组腺病毒Ad-PTEN-EGFP对肺癌细胞A549的体外实验研究

目的探讨Ad-PTEN-EGFP对肺癌细胞株A549的体外杀伤作用及机制。方法观察Ad-PTEN-EGFP感染肺腺癌A549细胞后的形态学变化;检测PTEN基因和蛋白在A549细胞中的转录及表达;观察Ad-PTEN-EGFP对A549细胞生长抑制作用;检测Ad-PTEN-EGFP对A549细胞凋亡率的作用。结果 Ad-PTEN-EGFP感染A549细胞后细胞形态明显出现变化,生长受到抑制,而其他对照组细胞正常生长;Ad-PTEN-EGFP感染A549细胞后可表达PTEN基因和PTEN蛋白;与对照组比较,Ad-PTEN-EGFP感染A549细胞后能明显抑制细胞的生长速度,并随着时间的延长其抑制率越强(P0.05);与对照组比较,Ad-PTEN-EGFP感染A549细胞后,细胞的凋亡率明显升高(P0.05)。结论 Ad-PTEN-EGFP能够有效抑制A549细胞的生长增殖,并诱导和促进A549细胞的凋亡。     

反义c-myc重组腺病毒载体的构建及其对大鼠胸腺淋巴细胞的增殖抑制作用

目的:观察反义c-myc重组腺病毒载体对大鼠胸腺淋巴细胞的增殖抑制作用.方法:构建大鼠反义及正义c-myc细菌质粒,并将所得细菌质粒与E1缺失腺病毒质粒导入293细胞系,经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体.MTS法检测重组腺病毒载体对大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用,RT-PCR检测重组腺病毒载体对c-myc mR-NA表达的影响.结果:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠淋巴细胞增殖,降低淋巴细胞c-myc mRNA的表达.结论:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠淋巴细胞增殖.     

硒对猪细小病毒体外增殖抑制作用的研究

本文以PK-15细胞为模型,研究了亚硒酸钠、硒蛋氨酸和海藻硒多糖等三种硒化合物对猪细小病毒体外复制 的抑制作用,以及还原型谷胱甘肽、D-甘露醇等氧自由基清除剂对不同来源硒的抑制病毒作用的影响。结果表明: 三种硒化合物对猪细小病毒在PK-15中的复制呈现不同程度的抑制作用,在相同浓度时其强度依次为硒蛋氨酸、 亚硒酸钠、海藻硒多糖,随着浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,呈剂量依赖性关系。还原型谷胱甘肽和甘露醇均 有增强硒的抑制病毒复制作用,两者同时添加时,协同增强硒的抑制病毒复制作用。     

硒对猪细小病毒体外增殖抑制作用的研究

本文以PK-15细胞为模型,研究了亚硒酸钠、硒蛋氨酸和海藻硒多糖等三种硒化合物对猪细小病毒体外复制的抑制作用,以及还原型谷胱甘肽、D-甘露醇等氧自由基清除剂对不同来源硒的抑制病毒作用的影响.结果表明三种硒化合物对猪细小病毒在PK-15中的复制呈现不同程度的抑制作用,在相同浓度时其强度依次为硒蛋氨酸、亚硒酸钠、海藻硒多糖,随着浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,呈剂量依赖性关系.还原型谷胱甘肽和甘露醇均有增强硒的抑制病毒复制作用,两者同时添加时,协同增强硒的抑制病毒复制作用.     

一氧化氮对猪细小病毒体外增殖的影响研究

本文研究了来源于不同前体物的一氧化氮(Nitro oxide,NO)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)体外增殖的影响.结果表明,NO前体物S-硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、L-精氨酸(L-Arg)均能够有效地诱导PK-15细胞产生NO,进而显著地抑制PPV在PK-15细胞上的复制,其效果与前体物的浓度呈正相关,在浓度为100μmol/L和200μmol/L时,SNAP产生NO的能力与抑制病毒复制的作用要强于L-Arg.在病毒感染前6 h和3 h添加SNAP或L-Arg对病毒复制的抑制作用比在病毒感染后3 h和6 h添加的作用强,表明NO的抗病毒作用主要发生在病毒感染的初始阶段.此外,添加具有抑制L-Arg产生NO作用的N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)能抵消L-Arg体外抗病毒的作用.     

Adenovirus-mediated expression of both antisense ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase inhibits lung cancer cell growth

Polyamine biosynthesis is controlled primarily by ornithine decarboxylase (ODC) and Sadenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC). Antisense sequences of ODC and AdoMetDC genes were cloned into an adenoviral vector (named Ad-ODC-AdoMetDCas). To evaluate the effects of recombinant adenovirus Ad-ODC-AdoMetDCas that can simultaneously express both antisense ODC and AdoMetDC, the human lung cancer cell line A-549 was infected with Ad-ODC-AdoMetDCas or the control vector. Viable cell counting, determination of polyamine concentrations, cell cycle analysis, and Matrigel invasion assays were carried out to assess the properties of tumor growth and invasiveness. Our study showed that adenovirus-mediated antisense ODC and AdoMetDC expression inhibits tumor cell growth through blocking the polyamine synthesis pathway. Tumor cells were arrested at the G_1 phase after gene transfer and the invasiveness was reduced. It suggested that the recombinant adenovirus Ad-ODC-AdoMetDCas might be a new anticancer reagent in the treatment of lung cancers.     

刚毛柽柳腺苷甲硫氨酸脱羧酶（ThSAMDC）基因的克隆与胁迫下的表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosyl-L-methionine decarboxylase,SAMDC）是一种通过参与多胺的代谢途径来调节植物生理生化过程的限速酶。通过分析刚毛柽柳（Tamarix hispida）的转录组数据,获得并克隆了SAMDC基因的cDNA序列,将其命名为ThSAMDC。该cDNA序列全长2085bp,包含tiny ORF（tORF）、upstream ORF（uORF）和main ORF（mORF）3个植物SAMDC基因特征ORF。主开放读码框（mORF）长1107bp,编码369个氨基酸多肽,相对分子质量为40.34kD,理论等电点（PI）为4.72。ThSAMDC编码蛋白具有多个较强的亲水性区域,无明显跨膜区。通过与其他多个物种的氨基酸多序列比对结果表明,ThSAMDC具有两个典型的高度保守的结构域：酶原剪切位点（LSESSLF）与蛋白快速降解有关的PEST（TIHVTPEDGFSYAS）结构域。系统发育树结果表明ThSAMDC与菠菜（SoSAMDC）氨基酸序列一致性最高,为77%。实时荧光定量RT-PCR分析显示,ThSAMDC在NaCl、PEG、ABA、CdCl₂诱导表达均上调,预示着ThSAMDC可能在刚毛柽柳非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。     

以胰岛素样生长因子受体1基因为靶的反义寡核苷酸体内外抗肿瘤研究

以胰岛素样生长因子受体－1基因为靶筛选抗肿瘤药物.根据IGF1RmRNA的二级结构设计了9条反义寡核苷酸药物,以脂质体介导进行转染,MTT染色计算细胞生长抑制率,从中筛选出一条序列并对之进行优化,最后以最佳序列进行体外作用持续时间及体内细胞生长抑制率分析.结果表明该序列在体内外具有良好的抗肿瘤活性,具有剂量依赖性关系,且对荷瘤裸鼠无明显的毒性.IGF1R可作为肿瘤治疗的新靶点.     

Expression of the cloned genes encoding the putrescine biosynthetic enzymes and methionine adenosyltransferase of Escherichia coli (speA, speB, speC and metK)

The speA, speB and speC genes, which code for arginine decarboxylase (ADCase), agmatine ureohydrolase (AUHase) and ornithine decarboxylase (ODCase), respectively, and the metK gene, which encodes methionine adenosyltransferase (MATase), have been cloned. The genes were isolated from hybrid ColE1 plasmids of the Clarke-Carbon collection and were ligated into plasmid pBR322. Escherichia coli strains transformed with the recombinant plasmids exhibit a 7- to 17-fold overproduction of the various enzymes, as estimated from increases in the specific activities of the enzymes assayed in crude extracts. Minicells bearing the pBR322 hybrid plasmids and labeled with radioactive lysine synthesize radiolabeled proteins with M_rs corresponding to those reported for purified ODCase, ADCase and MATase. Restriction enzyme analysis of the plasmids, combined with measurements of specific activities of the enzymes in crude extracts of cells bearing recombinant plasmids, clarified the relative position of speA and speB. The gene order in the 62- to 64-min region is serA speB speA metK speC glc.     

Caveolin-1抑制胰腺癌细胞PANC1的体内外生长和增殖

窖蛋白-1(caveolin-1)是胞膜窖(caveolae)中重要的结构和功能蛋白.Caveolin-1参与细胞的多种生命活动并与恶性肿瘤的发生相关.为探讨caveolin-1对胰腺癌细胞PANC1的体外增殖、迁移、侵袭以及裸鼠体内成瘤能力的影响,通过基因转染技术培育caveolin-1过表达细胞株PANC1/cav-1作为实验组,转染空载体细胞株PANC1/vector作为对照组,采用RT-PCR及Western blot方法检测caveolin-1的表达量,流式细胞术分析细胞周期,软琼脂细胞克隆实验检测细胞增殖能力,侵袭小室实验检测癌细胞迁移和侵袭的能力,建立裸鼠皮下种植瘤模型并检测肿瘤组织的增殖与凋亡.PANC1/cav-1中的caveolin-1表达稳定,表达量明显高于对照组细胞株和亲本细胞株(P<0.01),细胞周期检测显示大量PANC1/cav-1细胞被抑制于G0/G1期,caveolin-1抑制PANC1的增殖,迁移和侵袭能力.在裸鼠的体内实验中,caveolin-1显著抑制PANC1细胞在裸鼠体内的生长,Ki-67染色和TUNEL染色表明在PANC1细胞中过表达caveolin-1,可以抑制肿瘤增殖并诱导肿瘤凋亡.上述结果表明,caveolin-1可能通过对胰腺癌细胞周期的影响(抑制于G0/G1期),抑制胰腺癌PANC1细胞在体内外的增殖、迁移和侵袭,并导致肿瘤凋亡.     

miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭

目的:以非小细胞肺癌A549细胞为模型,探讨miR-490-3p在肺癌发生发展过程中的作用及其调控机制。方法:通过miRBase数据库获得miR-490-3p序列,设计miR-490-3pmimics并转染A549细胞,CCK8、细胞划痕及Transwell实验分别检测miR-490-3p过表达对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;使用miRwalk在线工具预测miR-490-3p可能的调控基因,通过实时荧光定量PCR及Western印迹对候选调控基因进行筛选,最后通过双萤光素酶报告基因实验验证miR-490-3p与调控基因之间的靶向关系。结果:过表达miR-490-3p可显著抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力;在预测的miR-490-3p候选靶基因中,选择与细胞增殖、迁移等表型相关的RASAL2、TGFBR1、PAPPA、HMGA2、TGFA靶基因进行实时荧光定量PCR及Western印迹筛选,结果仅TGFBR1基因在mRNA和蛋白水平的表达与miR-490-3p水平呈负相关,且双萤光素酶报告实验证实miR-490-3p可直接与TGFBR1的3'-UTR结合并抑制其表达。结论:miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1的表达抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖和侵袭。     

MicroRNA-575靶向抑制BLID促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭

目的:通过体外实验探讨miR-575对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖与侵袭能力的影响及相关机制。方法:采用实时定量PCR法检测不同非小细胞肺癌细胞系中miR-575、BLID的表达;CCK-8法检测转染miR-575模拟物、抑制因子后不同时间A549细胞增殖情况的变化;Transwell法检测A549细胞的侵袭情况;Targetcan法及双荧光素酶检测miR-575对BLID 3'UTR端的靶向作用;Western blot法检测BLID蛋白的表达。结果:A549、SPC-A1、H1299、H1650等人非小细胞肺癌细胞系中miR-575的表达均显著高于永生化的人支气管上皮细胞系16HBE(P0.001)。MiR-575模拟物转染的A549细胞miR-575的表达明显高于对照组(P0.001),同时细胞的增殖和侵袭力增强(P0.05);反之,miR-575抑制因子转染的A549细胞miR-575的表达显著降低,且细胞的增殖和侵袭力明显降低(P0.01)。Targetscan法预测BLID可能是miR-575的下游靶基因,荧光素酶结果显示miR-575不仅能够有效抑制野生型BLID 3'UTR端的荧光素酶反应(P0.01),而且能够降低BLID的蛋白表达量(P0.01)。实时定量PCR结果显示BLID在NSCLC细胞系中均呈现显著的低表达(P0.001),且转染BLID后,NSCLC细胞的增殖和细胞侵袭被明显抑制(P0.05),而当miR-575与BLID共转染时,miR-575能够逆转BLID所抑制的细胞增殖和侵袭(P0.01)。结论:在NSCLC细胞系中,miR-575的表达上调,且能够通过直接作用于下游靶点抑癌基因BLID从而促非小细胞肺癌细胞增殖及侵袭。