整合人lactoferrin基因的山羊体细胞支持核移植克隆胚的体外发育

克隆了人lactoferrin基因和山羊[[beta]]-casein基因5′端调控区, 构建了人lactoferrin的乳腺表达载体, 并将该载体利用脂质体介导转染了奶山羊胎儿成纤维细胞, 获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因体细胞克隆17个, 其中PCR和Southern Blot检测阳性的细胞克隆14个, 阳性率82.4%。以转基因体细胞为供体细胞进行了核移植, 获得了能够体外发育的山羊转基因克隆胚胎, 体内成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为64.8%, 体外成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为51.7%, 证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚的进一步发育。     

山羊卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响。方法根据质量将卵巢分为3组,Ⅰ组质量小于0.95 g,Ⅱ组质量介于0.95~1.7 g,Ⅲ组质量大于1.7 g,并统计了不同组卵母细胞的体外成熟率、孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率,以及克隆胚的卵裂率和囊胚率。结果 3组卵母细胞体外成熟率分别为62.25%、43.58%和40.7%;3组孤雌激活胚卵裂率分别为83.77%、82.92%和79.73%;孤雌激活胚囊胚发育率分别为19.51%、18.9%和18.78%;3组克隆胚的卵裂率分别为67.36%、65.97%和66.33%;克隆胚囊胚发育率分别为11.63%、13.41%和12.29%。Ⅰ组卵母细胞体外成熟率显著高于其余2组,3组之间孤雌激活胚卵裂率、孤雌激活胚囊胚率、克隆胚卵裂率和克隆胚囊胚发育率差异无统计学意义。结论上述结果表明来源于小卵巢的卵母细胞体外成熟率最高。卵巢大小仅影响卵母细胞的体外成熟率,对发育能力无影响。     

不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响

系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40~44 h的猪卵母细胞去核后, 将经血清饥饿(0.5%FBS)培养2~9天、0.1 mg/L Aphidicolin(APD)培养+0.5% FBS培养2~9天或一般培养法(10% FBS)培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞, 直接注射到去核的卵母细胞质中, 或注射到卵周隙中, 再经电融合(100 V/mm, 30 [mu]s, 电脉冲1次)构建重构胚。重构胚以钙离子载体A23817 或电脉冲结合6-DMAP 激活处理, 体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1 mg/L APD + 0.5% FBS培养处理后的重组胚卵裂率, 均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P<0.01)。卵丘细胞、颗粒细胞经0.1 mg/L APD + 0.5% FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞(P<0.05)。以猪颗粒细胞为核供体时, 电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P<0.05), 但囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞, 其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P>0.05); 以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时, 各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。这些结果表明: (1) 猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定; (2) 0.1 mg/L APD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果, 血清饥饿培养则无明显效果; (3) 猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞, 核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚, 但前者的效果略优于后者, 且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响; (4) 电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法, 但两者的总体效率相近。     

成年耳细胞克隆山羊(Capra hircus)

繁殖季节采集关中奶山羊卵巢,采集获得可用卵母细胞5.5枚/卵巢(1815/330).经约20 h 成熟培养,第一极体排放率66.17%(1201/1815).将有类第二极体排出结构的成熟卵母细胞去核,去核率75.44%(906/1201).培养济宁青山羊耳部皮肤成纤维细胞传2代后液氮冷冻,解冻培养3~6代,用0.5% FBS饥饿2~10 d作为供体细胞.利用卵母细胞胞质内注射法将分离的供体细胞核胞体注入到去核卵母细胞内,注核成功率98.12%(889/906).克隆胚胎用5μmol/L 离子酶素激活4.5 min, 在含2 mmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6 dime-thylaminopurine,6-DMAP)的培养液中培养3 h,然后在mCR1aaBF培养液中培养36 h,卵裂率76.69%(645/841).其中由未经冷藏处理供体细胞克隆得到308枚胚胎,激活后卵裂率、4-细胞发育率、囊胚发育率分别为68.5%(211/308),59.72%(126/211)和17.46% (22/126);另外,由4℃冷藏处理24h供体细胞获得的109枚克隆胚胎,激活率、4-细胞率、囊胚率分别为72.48%(79/109),53.16%(42/79)和19.05%(8/42).统计学分析表明,4℃处理供体细胞对克隆胚胎的早期发育没有显著影响.将102枚发育至4-细胞期的克隆胚胎移植到17只自然发情2~3 d 的受体山羊输卵管,其中非冷藏供体细胞克隆的84枚胚胎移植后没有产仔.18枚冷藏体细胞克隆的胚胎移植获得1只发育足月的克隆山羊.将冷藏或非冷藏处理供体细胞克隆得到的19枚体外发育囊胚移植到自然发情6~8 d 的受体山羊,结果无一产仔.未经冷藏处理供体细胞克隆得到的18枚体外发育桑椹胚移植到自然发情5 d受体山羊后获得1只足月羔羊.微卫星引物PCR扩增结果证实2只克隆山羊来源于同一供体细胞.     

人-山羊异种核移植胚胎发育的初步研究

以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体,经血清饥饿培养后,通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中,采用化学方法激活重组胚.通过体外培养观察,2-细胞胚胎发育率可达51.33%,4-细胞发育率为31.42%,但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少,仅为9.73%.虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚,但实验结果说明山羊成熟卵母细胞可以支持人体细胞核完成重编程,人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育.     

人-牛异种克隆胚构建及其线粒体来源

通过人-牛异种核移植技术获得异种克隆囊胚, 便于在不消耗人类卵母细胞的情况下从异种克隆胚中分离出人类干细胞。通过透明带下注射法将人胎儿成纤维细胞和牛耳成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建异种和同种胚胎, 并比较两者之间的融合率、卵裂率、8-细胞发育率以及囊胚率。并对处于2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚阶段的异种克隆胚的线粒体DNA来源进行检测。结果表明, 异种克隆胚体外各个阶段的发育率均低于同种克隆胚, 尤其是8-细胞到囊胚阶段的发育率, 以及囊胚率都显著低于同种克隆胚(P<0.05)。异种克隆胚在2-细胞到桑椹胚阶段检测到人、牛线粒体DNA共存, 囊胚阶段只检测到牛线粒体DNA。结果表明: 牛卵母细胞可以重编程人胎儿成纤维细胞, 完成异种克隆胚植入前的胚胎发育, 异种克隆胚由于核质相互作用的不谐调, 影响其发育能力, 使其囊胚率显著低于同种克隆胚。牛线粒体DNA存在于植入前异种胚胎发育的各个阶段。异种克隆胚胎用于人类胚胎干细胞分离具有可行性。     

共培养体系在牛核移植胚体外发育培养中的应用

采用电融合法构建牛体细胞核移植重构胚,分析共培养细胞类型、传代次数、细胞冻-融以及蛋白质添加物(BFF和FBS)对牛体细胞核移植胚体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养的条件,以建立优化的共培养体系。结果表明与非共培养组相比,共培养组重构胚的囊胚发育率以及胚胎细胞数显著增加(P<0.05),而输卵管上皮细胞共培养组同颗粒细胞共培养组相比胚胎细胞数显著增加(P<0.05),更适合做共培养细胞;随着共培养细胞传代次数的增加重构胚囊胚发育率及胚胎细胞数显著下降(P<0.05),共培养细胞在冷冻处理后重构胚的囊胚率和胚胎细胞数都显著下降(P<0.05);BFF较FBS更能促进牛核移植胚的囊胚发育率(P<0.05)。表明应用新鲜原代输卵管上皮细胞进行牛核移植胚胎的共培养,并在SOFaa添加10?F能够有效促进核移植胚胎的体外发育。     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

人-兔异种核移植构建克隆胚的实验研究

“治疗性克隆”是人类最关注的课题之一,而人体细胞核移植是治疗性克隆的基础和前提。异种核移植的方法虽已被引入人体细胞克隆胚的构建,但供体细胞的类型、培养代数及准备方法与其效率之间的关系尚有待探讨。本实验以不同培养代数和不同准备方法的人卵丘细胞、皮肤成纤维细胞和软骨细胞为供体构建了克隆胚,对其发育情况的比较表明,以卵丘细胞为供体时重构胚的体外发育率高于其余二者,差异显著（P〈0．05）;不同培养代数的成纤维细胞克隆胚和不同冷藏天数供体细胞克隆胚体外发育率无明显差异。此外,本实验还尝试用荧光原位杂交法检测所构建的异种克隆胚核遗传物质的来源,结果显示来自人体细胞。本研究表明,人一兔异种核移植构建克隆胚切实可行;体细胞的类型与核移植效率相关;供体细胞的体外培养传代对克隆胚的发育并无影响;而冷藏是一种简便有效的供体细胞准备方法;此外,用FISH方法对重构胚进行核遗传物质的鉴定切实可行。     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.