熊猴存在TRIM5/TRIMCyp杂合子基因型

缺乏合适的动物模犁是制约艾滋病研究取得重大突破的关键瓶颈之一.细胞内的抗病毒蛋白被称为限制因子.研究不同灵长类动物抗HIV-1宿主限制因子的存在形式及作用机制对建立合适AIDS灵长类动物模型有十分重要的意义.TRIM5α是哺乳动物细胞中一种重要和关键的限制因子,它以物种依赖的方式限制包括HIV-1在内的逆转录病毒的感染.TRIM5-CypA融合基因是存在于新大陆猴与旧大陆猴中的一种独特的TRIM5基因形式.为了研究不同灵长类动物TRIM5基因的存在方式,该文对熊猴、藏婀猴、红面猴及中闰恒河猴4个物种共110只灵长类动物进行了TRIM5-CypA融合模式的研究.首次发现熊猴也存在TRIM5-CypA基因融合现象.熊猴TRIMCyp融合基因形成模式类似于北平顺猴TRIMCyp融合基因模式,即CypA假基因的cDNA序列通过逆转座方式插入到TRIM5基凶的3'-UTR区域.基因序列分析表明,该基因与北平顶猴相应基因序列高度相似;并且其TRIM5内含子6的3'-剪接位点也相应存存G-to-T突变现象(G/T).这提示熊猴也极有可能像北平顶猴一样表达TRIM5-CypA融合蛋白,从而导致熊猴可能跟北平顶猴一样可能被HIV-1感染.因此,熊猴极有希望成为一种新的HIV/AIDS灵长类动物模型.     

灵长类动物中TRIMCyp融合基因模式及对逆转录病毒复制的限制作用

TRIM5-CypA融合基因(TRIMCyp)是一种独特的TRIM5基因形式。迄今已发现新大陆猴中包括鹰猴在内的夜猴属所有代表种,以及在北平顶猴、巽他平顶猴、食蟹猴、印度恒河猴和熊猴等旧大陆猴中均存在这种基因融合现象,但在新大陆猴与旧大陆猴中的TRIMCyp融合基因的基因融合模式和表达剪接方式不同。新大陆猴TRIMCyp融合基因是由CypA假基因的cDNA序列通过LINE-1逆转座子介导的逆转座方式插入至TRIM5α基因的第7和第8外显子之间的内含子中形成,而旧大陆猴TRIMCyp融合基因则是由CypA假基因的cDNA序列以相似的逆转座方式插入至TRIM5基因的3’非翻译区(untranslatedregions,UTR)形成。TRIMCyp融合基因在不同灵长类动物中的存在比例、基因型、TRIMCyp融合蛋白的表达以及对逆转录病毒的限制活性均有所差异。鹰猴和平顶猴的TRIMCyp融合基因研究较多,鹰猴TRIMCyp融合蛋白可能以与TRIM5α相似机制限制HIV-1的感染,而平顶猴TRIMCyp融合蛋白则丧失了限制HIV-1的作用。这两个功能截然不同的融合基因为TRIM5α作用机制研究提供了难得的实验材料,也为建立HIV-1感染的新型灵长类动物艾滋病模型奠定了科学依据。该文综述了TRIMCyp融合基因在灵长类动物中的分布、存在形式及其限制逆转录病毒复制的作用机制等方面的研究情况。     

神农架川金丝猴投食群TRIM5 alpha基因的变异及其进化分析

目的:本研究探索神农架大龙潭川金丝猴TRIM5alpha蛋白序列的特征、变异、该基因进化特点以及该基因的遗传多样性,对金丝猴的保护和研究具有重要的意义。方法:从神农架川金丝猴投食群随机选择41个个体,采集毛发并提取基因组DNA,设计引物,对其TRIM5 alpha基因编码序列进行PCR扩增和测序,最后对序列进行比对和分析。结果:在神农架川金丝猴投食群41个个体中,TRIM5alpha基因不存在与Cyp A假基因序列融合的现象。与恒河猴序列不同而与人类相似的是,川金丝猴中没有发现TFP339-341型,而只发现△△Q339-341型。41个个体TRIM5alpha蛋白序列没发现任何非同义突变位点,显示该基因在该种群中具有很低的遗传多样性。编码序列的进化分析表明,Coiled-coil结构域和SPRY结构域在进化中经历了明显的正向选择,Ring结构域和B-box结构域则经历了纯化选择。结论:川金丝猴TRIM5 alpha基因存在很多独特变异位点,且经历了明显的正向选择。对投食群的研究表明该基因编码序列在该种群中多样性很低,这从侧面反映了该总群较低的遗传多样性。针对这种情况,建议在种群复壮的工作中,适当引入一批有效的建群者。     

中国圈养食蟹猴TrimCyp基因频率

TRIM 5α在绝大部分的旧大陆猴中扮演抗逆转录病毒的角色,能够限制HIV-1的活性。TRIMCyp融合基因是继TRIM 5α后的另一个抗HIV-1因子研究热点。旧大陆猴的TRIMCyp融合基因是由CypA假基因cDNA序列以逆转录转座的方式插入至TRIM5基因的3’非翻译区形成,而且TRIMCyp融合基因在不同灵长类动物中具有地域、基因频率、基因型以及抗逆转病毒效应的差异。虽然食蟹猴TRIMCyp基因的频率在东南亚几个国家或地区已经被初步调查,但是,中国大陆食蟹猴养殖场的TRIMCyp基因频率还没有明确阐明。该研究对中国5个省11个养殖场共1594个食蟹猴(Macaca fascicularis)繁殖种群随机样本的TRIMCyp基因频率进行了筛查研究,发现各场频率略有差异,从7.65%～19.79%不等,显著低于已报道的菲律宾、马来西亚和印度尼西亚来源食蟹猴的TRIMCyp基因频率(34.85%~100%)。该原因可能是由于后者是建立于1978年的封闭群。对带有TRIMCyp融合基因的个体CypA测序发现带有NE单倍型的食蟹猴个体很少,NE单倍型频率(4.93%)显著低于东南亚三个国家食蟹猴的NE单倍型频率(11.1%～14.3%)纯合子。该研究为进一步开展食蟹猴HIV-1动物模型和发病机制提供了基础信息。     

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株,为进一步研究TRIM5α基因的功能奠定基础。构建针对TRIM5α打靶基因的TALEN,通过点突变的方法获得包含TRIM5α第7个外显子中打靶位点1 211-1 224的基因序列并构建点突变donor载体。将打靶TRIM5α基因的TALEN质粒和donor质粒电转入恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中,无限稀释法获得单克隆细胞系,通过抽提基因组DNA,再利用PCR技术扩增目标序列并测序筛选出TRIM5α碱基缺失(1 215-1 216)和点突变(1 213-1 215,1 217)的细胞系。通过共转TALEN质粒和点突变的donor质粒筛选获得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因点突变的LLC-MK2细胞系。     

逆转座子对灵长目动物基因组结构的影响

逆转座子(retroposon)是动物基因组中一类可移动的元件,它们首先通过转录产生一个RNA拷贝,然后利用逆转录酶将该RNA拷贝逆转录为c DNA后,再插入到基因组的新位点上。逆转座子在动物基因组中含量极为丰富,种类也很繁多,并随着动物进化在基因组中不断扩增。它们可通过形成插入突变、侧翼序列转导、基因逆转座、DNA断裂与修复、异常重组等机制对动物基因组结构的稳定性产生重要影响,并成为推动基因组进化的重要动力。本文综述了灵长目动物主要的逆转座子类型及其对基因组结构的影响方式,从而为深入理解逆转座子在灵长目动物基因组中的功能及灵长目动物的进化提供参考。     

人天然免疫基因TRIM5α的序列及进化分析

目的：克隆人TRIM5α基因,对其编码序列进行分析,并进行分子进化研究。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,用RT-PCR方法克隆人TRIM5α基因,与人基因组序列对比分析其结构;用BioEdit、Genedoc和MEGA4.1软件进行蛋白序列联配和进化分析。结果：扩增了长1482bp的人TRIM5α基因片段,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由493个氨基酸残基组成的人TRIM5α蛋白;人TRIM5α蛋白与黑猩猩、大猩猩、猩猩、猕猴TRIM5α蛋白的相似度分别为98.2%、96.8%、93.7%和87.6%。结论：克隆了人TRIM5α基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

实验动物恒河猴朊病毒基因分析

目的　通过对拟应用于航天飞船模拟试验的实验动物恒河猴进行朊病毒基因检测和分析 ,了解其朊病毒疾病易感性 ,进而为该试验所用实验动物质量提供朊病毒疾病的遗传数据。方法　根据已报道的猴朊病毒基因序列设计引物对 ,采用PCR方法扩增恒河猴朊病毒基因 ,将其克隆到T—VECTOR ,序列测定及分析。结果　序列测定及分析表明所克隆的恒河猴PRNP基因片段为 76 2bp ,该基因内无内含子 ,包含了PRNP完整编码区序列 ,编码 2 5 3个氨基酸的前体蛋白 ,推测其相对分子质量约 2 7 6× 10 3。与已报道的猴的相应序列作比较 ,核苷酸序列同源性分别为 95 %以上 ,其编码的氨基酸同源性均为 95 %以上。其中发现了已报道的多态性位点N97S ,H10 0N和未曾见报道的Q5 2E点突变位点 ,以及沉默突变位点A78G ,T84C ,T4 95C ,A5 6 4G ,C6 5 4 ,未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态位点P10 2L、M12 9V ,N171S和E2 19K。结论　航天医学实验所用 17只恒河猴不存在朊病毒敏感性基因。     

TRIM25在抗病毒天然免疫及恶性肿瘤发生发展中作用的研究进展

三基序蛋白25 (tripartite motif 25, TRIM25)是一种E3泛素连接酶,其介导的维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)泛素化是启动细胞内抗病毒反应的重要步骤。近期研究发现,TRIM25还能通过其他途径调节宿主抗病毒能力,包括RIG-Ⅰ的负调节、黑色素瘤分化相关基因5 (melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)的激活、增强锌指抗病毒蛋白(zinc-finger antiviral protein, ZAP)活性、抑制病毒RNA合成。与此同时,病毒与宿主能通过多种机制调节TRIM25,包括泛素化降解、与细胞和病毒RNA结合、与RIG-Ⅰ的结合、竞争TRIM25作用底物。TRIM25在肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。为了更好地了解TRIM25在抗病毒天然免疫与肿瘤发生发展中的作用及其机制,现对近年TRIM25在这两方面的研究进展进行总结。     

恒河猴TRIM5α的组织分布及不同刺激促进PBMC中TRIM5α转录水平的上调

TRIM5α(tripartite motif protein 5-alpha)蛋白是恒河猴体内一种非常重要的限制因子,能抑制人免疫缺陷病毒(HIV-1, human immunodeficiency virus type 1)、马感染性贫血病毒(EIAV, equine infectious anemia virus)和猫免疫缺陷病毒 (FIV, feline immunodeficiencyvirus)等逆转录病毒的复制。恒河猴TRIM5α的组织分布以及在受到外界刺激时TRIM5α mRNA表达量的变化研究还未见报道。本研究从中国恒河猴的各组织中提取总RNA,以β-actin基因作为内参照,通过半定量RT-PCR检测各组织中TRIM5α mRNA的表达。选择HIV-GFP-VSVG假病毒感染外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,非特异性刺激剂——佛波脂(Phorbol myfismte acetate,PMA)+离子霉素(ionomycin,Ion)及CD28抗体+CD49d抗体分别共刺激恒河猴PBMC,研究不同刺激对恒河猴TRIM5α mRNA表达水平的影响。结果表明：TRIM5α mRNA表达于所研究的恒河猴21种组织中,免疫系统和泌尿生殖系统组织中表达量最高,而神经系统组织,如大脑、脊髓中表达较少,其他组织中未见明显的表达差异;HIV-GFP-VSVG感染和用PMA+Ion、CD28抗体+CD49d抗体分别共刺激PBMC能促进 PBMC中TRIM5α mRNA的转录水平的上调。