干细胞多能性信号调控机制研究进展

多能性干细胞是一类具有体外无限自我复制和分化为体内多种细胞类型能力的多潜能细胞,是研究基因功能、建立疾病模型和促进再生医学领域发展的一种重要工具。自1981年小鼠胚胎干细胞建立以来,科学家们已经先后成功地建立了灵长类、人、大鼠的胚胎干细胞和小鼠、大鼠的上胚层干细胞等。但是,目前研究表明,维持人、灵长类胚胎干细胞的多能性信号通路与维持小鼠、大鼠胚胎干细胞的截然不同,而与维持小鼠、大鼠上胚层干细胞的信号通路比较类似。因此,该文对目前研究较多的维持小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞和小鼠上胚层干细胞的多能性信号通路进行了综述,希望能够对其它物种的多能性干细胞研究提供有益的借鉴。     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

FEZF 1在人胚胎干细胞早期神经分化过程中的作用研究

研究模型的缺乏和人源细胞的伦理问题极大地限制了人早期神经发育机制的研究.人胚胎干细胞具有体外无限增殖和分化为人体内各种细胞的能力,为研究人神经发育提供了重要的工具.本研究利用化学成分确定的神经诱导体系和高通量筛选策略,发现Fez锌指家族1(FEZF1)在人胚胎干细胞神经分化过程中快速表达,且先于人神经前体细胞标志基因PAX6的表达,提示FEZF1是人早期神经发育中的重要调控因子.随后利用CRISPR/CAS9技术构建了FEZF1敲除的人胚胎干细胞株,发现敲除FEZF1阻碍了人胚胎干细胞的神经分化进程.此外,FEZF1敲除抑制了人胚胎干细胞神经分化过程中多能性的丢失,部分揭示了FEZF1缺失引起神经发育缺陷的机制.然而,单独过表达FEZF1并不能驱动人胚胎干细胞的神经分化,表明FEZF1是神经分化的必需调控因子,却不足以启始人胚胎干细胞的神经分化.总之,本研究发现了FEZF1是人早期神经分化的重要调控因子,为理解人神经发育奠定了理论基础.     

早期胚胎细胞谱系研究——揭示生命发育早期的黑盒子

哺乳动物的早期胚胎发育,通过多个层次的细胞命运决定,建立了胚胎器官发生、形态建成的整体发育蓝图,是生命体最重要的分子事件之一。早期胚胎发育过程伴随了全能性的维持和分化,以及各种多能干细胞命运的次序决定,任何发育进程上的缺陷都会对整个胚胎个体产生深远的影响。因此,研究早期胚胎谱系建立的过程、不同胚层和组织前体细胞的命运决定及其发生与发展的调控机制,不仅仅是面对国家人口政策的变化以及优生优育的需求,预防和减少早期发育疾病,还能够指导胚胎干细胞及各种多能干细胞的分化和进一步转化医学应用,因而具有极其重要的生物学意义。     

Lefty1对小鼠胚胎干细胞分化过程的影响

目的:研究Lefty1在小鼠胚胎干细胞分化过程中的作用。方法:根据染色质免疫沉淀测序结果,在临近Lefty1转录起始位点以及与之相距10 kb的上游区域有TGF-β信号通路Smad2/3蛋白的四个结合区域,通过CRISPR/Cas9方法获得四个区域敲除的单克隆细胞,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测各细胞中Lefty1的转录水平,并用TGF-β信号通路的激活剂AC和抑制剂SB分别处理敲除的细胞,检测其对TGF-β信号的响应,最后通过胚状体形成实验,检测敲除细胞系在中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。结果:利用CRISPR/Cas9方法成功获得不同区域敲除的单克隆细胞,与野生型E14细胞相比,四种区域敲除的细胞中Lefty1 RNA含量明显降低,并且在干细胞状态和分化状态下,敲除细胞系对TGF-β信号的响应减弱。在胚状体形成的实验中,与野生型E14细胞相比,敲除细胞系在分化过程中Lefty1表达的基础水平明显降低,中内胚层分化的标志分子Gsc和Mixl1转录水平也明显下降。结论:在胚胎干细胞中,Lefty1转录起始位点附近以及上游10 kb的这四段区域通过TGF-β信号通路对Lefty1的转录发挥调控作用,从而影响中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。     

Stella基因真核表达载体的构建及其对小鼠胚胎干细胞多能性的影响

构建Stella基因真核表达质粒,转染小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)并初步探讨Stella对减数分裂起始相关基因(Stra8)及胚胎干细胞多能性的影响。通过RT-PCR扩增目的基因,并连接至真核表达载体pEGFP-C1,利用重组质粒转染小鼠胚胎干细胞。对转染细胞进行荧光检测,确认Stella的表达,并利用免疫荧光及PCR检测转染细胞基因表达情况。酶切鉴定及测序分析表明成功构建含Stella基因的重组真核表达质粒,过表达Stella对ES细胞的增殖和形态学特征、进入减数分裂阶段的相关基因及其多能性基因的表达影响并不显著。故此得出结论:Stella在小鼠胚胎干细胞中能够正确表达,但对ES细胞的分化、Stra8基因的表达及其多能性基因的表达并无显著影响。     

利用CRISPR/Cas9系统在小鼠胚胎干细胞中进行miR-22的功能研究

旨在构造neomycin筛选标记的sgRNA表达载体,并利用CRISPR/Cas9技术构建miR-22缺失的小鼠胚胎干细胞,探究miR-22在小鼠胚胎干细胞中的调控作用。首先通过点突变、搭桥PCR等手段,构造neomycin筛选标记的sgRNA表达载体,并获得靶向敲除miR-22的sgRNA表达载体,电转至稳转Cas9的小鼠胚胎干细胞中;其次经药物筛选、基因型鉴定等步骤筛选miR-22纯合缺失的小鼠胚胎干细胞。RT-qPCR手段证实miR-22在小鼠胚胎干细胞中被成功敲除,纯合突变体的比例约为6.67%。此外,miR-22缺失并未影响胚胎干细胞的细胞形态以及Oct4、Sox2和Nanog等干性基因的表达。因此,miR-22对小鼠胚胎干细胞的干性维持并非必需,而对胚胎干细胞谱系分化和命运决定的影响还有待进一步研究。     

小分子物质对维持胚胎干细胞未分化状态的调控作用

胚胎干细胞作为一种具有多潜能和高度自我更新能力的种子细胞,己被广泛地应用于医学研究领域。在体外培养条件下,胚胎干细胞可被诱导分化为三个胚层来源的组织细胞,故被看作为最具有应用前景的种子细胞。近年来,对于在体外培养条件下如何维持胚胎干细胞的多能性即使其较长时期的处于未分化状态成为研究热点,其中一些天然存在或人工合成的小分子物质可通过作用于某些特定的靶信号通路,调控胚胎干细胞的分化命运。本文概述了几种小分子物质的最新研究进展,并对小分子物质在成体多分化潜能胚胎样干细胞分化调控方面的应用前景进行评述。     

原始生殖细胞发生的机制

生殖细胞的发生是发育和遗传的基础。在几乎所有哺乳动物中,原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)均由近端上胚层体细胞在周边细胞特定的信号诱导下特化而成。目前的研究已经发现一些与生殖细胞特化有关的信号分子和关键转录调控元件,以及特化后生殖细胞获得的与体细胞不同的生物特性。生殖细胞的特化是一个结合了体细胞发育程序的抑制、细胞多能性程序的启动和全基因组表观遗传重编程三个方面的动态的复杂过程。多能性干细胞(胚胎干细胞或诱导型多能干细胞)具有发育全能性,能分化为机体任何一种细胞类型,包括生殖细胞。利用多能性干细胞体外分化形成生殖细胞有助于深入系统地研究配子发生的调控机制,为干细胞在不育症治疗方面的应用带来新希望。     

原始生殖细胞发生的机制

生殖细胞的发生是发育和遗传的基础。在几乎所有哺乳动物中,原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）均由近端上胚层体细胞在周边细胞特定的信号诱导下特化而成。目前的研究已经发现一些与生殖细胞特化有关的信号分子和关键转录调控元件,以及特化后生殖细胞获得的与体细胞不同的生物特性。生殖细胞的特化是一个结合了体细胞发育程序的抑制、细胞多能性程序的启动和全基因组表观遗传重编程三个方面的动态的复杂过程。多能性干细胞（胚胎干细胞或诱导型多能干细胞）具有发育全能性,能分化为机体任何一种细胞类型,包括生殖细胞。利用多能性干细胞体外分化形成生殖细胞有助于深入系统地研究配子发生的调控机制,为干细胞在不育症治疗方面的应用带来新希望。     

体外小鼠胚胎性癌细胞BEC-B7建株和特性

恶性畸胎癌干细胞又叫做胚胎性癌细胞(简称EC细胞),是一种来自生殖细胞或早期胚胎细胞的恶性癌细胞,不仅具有类似于早期胚胎细胞分化多能性,而且能在一定条件下失去恶性生长性质,分化为各个胚层的正常组织。EC细胞是开展哺乳类胚胎早期发育遗传以及癌变和癌细胞分化研究较好的实验材料。EC细胞在体外可以大量培养生长,较之正常胚胎细胞更容易获取。我们在建立体内腹     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog基因表达的比较

目的：比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞（iPSCs）与人胚胎干细胞（hESCs）分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法：收集分化不同时间点的拟胚体（EBs）,检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果：iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论：通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog 基因 表达的比较

目的:比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞(iPSCs)与人胚胎干细胞(hESCs)分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法:收集分化不同时间点的拟胚体(EBs),检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果:iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论:通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

诱导性多能干细胞研究技术的现状与前景

2006年Takahashi研究小组成功地将小鼠的胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞重编成为诱导性多能干细胞(iPSC),开创了体细胞重编程的全新方法,所得iPSC具有和胚胎干细胞相似的生物学特性,不仅解决了人类胚胎干细胞研究所面临的伦理学困境和免疫排斥问题,而且进一步深化了对细胞多能性和基因组重编程的认识,再次掀起了干细胞研究的热潮。iPSC结合基因治疗和细胞治疗的成果已经应用到动物疾病模型上。iPSC能够自我更新并维持未分化状态,可分化为3个胚层来源的所有细胞,参与形成机体所有组织和器官,体外定向诱导能够分化出各种成体细胞,在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。但iPSC技术也存在一系列问题需要研究解决。     

利用piggyBac转座子制备牛成体多能干细胞诱导技术研究

通过逆转录病毒等媒介表达核转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc可将体细胞重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)。时至今日,已经报道了小鼠、人、大鼠、猪、羊、马、牛的iPS细胞,但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。与逆转录病毒等不同的是,piggyBac转座子转染效率高且无病毒源性、操作简单,可以在转座酶的存在下被安全切除。首次尝试了采用piggyBac转座子携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg和Lrh16个核转录因子诱导胎牛成纤维细胞,成功获得牛类iPS细胞,其形态与小鼠胚胎干细胞相似,克隆边界清晰、呈丘状、克隆内细胞致密、核大。RT-PCR与免疫组织化学染色分析均显示牛类iPS细胞表达多能性基因。该类细胞体外诱导分化可形成类胚体EB,且表达3个胚层的基因;体内诱导分化可形成畸胎瘤,苏木精、伊红染色显示瘤体有三胚层的分化。上述结果显示利用piggyBac转座子制备牛多潜能干细胞诱导技术可行,产生的牛类iPS细胞具有潜在多能性。     

小鼠上胚层多能干细胞研究进展

小鼠上胚层干细胞(mouse epiblast stem cell,mEpiSC)是一种来自于5.5天~7.5天小鼠胚胎上胚层(epiblast)组织的多能性干细胞。EpiSC自我更新能力和多能性的维持主要依赖激活素(Activin/Nodal)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)信号,Activin和FGF信号对细胞多能网络进行调控,EpiSC培养体系和分离方法目前仍处于不断优化的过程。相比于处于"幼稚(na?ve)"状态的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC),mEpiSC被认为处于"待发(primed)"状态。虽然mEpiSC被注射入囊胚后,细胞嵌合效率较低,但是当其被移植入着床后胚胎时,却比mESC更容易与受体胚胎发生嵌合。因此,来源于小鼠着床后胚胎的EpiSC与来自于着床前胚胎的ESC相比,在多能性维持、发育潜能和诱导方法等方面存在本质区别。该文对小鼠EpiSC和ESC进行比较,并综述目前小鼠EpiSC的研究进展。     

无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血诱导多能干细胞系的建立

β-地中海贫血患者因无合适的造血干细胞供体来源从而不得不靠输血维持生命。诱导多能干细胞(iPS)技术为获得患者自身遗传背景的干细胞进行临床治疗开拓了新途径。目前,建立iPS细胞系的过程需要使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层和动物源的蛋白成分,因此建立的iPS细胞系存在病原体和动物源蛋白污染的可能性,不能应用于临床。采用目前商品化的TeSRTM2和StemAdhereTMDefined Matrix限定培养体系,利用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子组装在同一表达载体的可切除的慢病毒感染人β-地中海贫血成纤维细胞,建立了5株无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血iPS细胞系,这些iPS细胞系具有人胚胎干细胞典型的特征,表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog、Tra-1-60等。在体外分化能够形成拟胚体,在体内分化能够形成含有3个胚层类型细胞的畸胎瘤。     

诱导多能干细胞研究进展

成熟的体细胞过表达转录激活因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc能够转化为具有多能性的干细胞,称为诱导多能干细胞。类似于胚胎干细胞,诱导多能性干细胞具有自我更新和多向分化潜能性两个主要特征。同胚胎干细胞相比,诱导多能干细胞不仅能够为以细胞替代治疗为核心的再生医学提供无限的细胞来源,而且有望解决胚胎干细胞临床开发面临的伦理道德及免疫排斥问题。从诱导多能干细胞技术的建立、重编程的机理及其在临床中的应用几方面作简要综述。     

SETD8~(–/–)抑制人胚胎干细胞向造血分化

表观遗传调控作为一种广泛的基因表达调控方式,已被报道可以参与干细胞多能性、谱系分化等生物学过程。虽然许多表观遗传调控因子的功能已被解析,但仍有一些并未被深入研究。SETD8(赖氨酸甲基转移酶5A, lysine methyltransferase 5A)作为一种甲基化转移酶,已被证实能够介导组蛋白H4第20位赖氨酸的单甲基化,并且可以参与细胞周期、P53介导的DNA损伤等过程。但是, SETD8是否可以直接调控人胚胎干细胞的多能性及其谱系分化还没有报道。该研究首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人的胚胎干细细胞中敲除SETD8。功能研究表明,敲除SETD8显著降低了多能性基因OCT4和NANOG的表达水平,并且抑制了体外造血发育过程。接着利用了siRNA在造血发育不同时期敲低STED8,发现均可以抑制造血发育过程,进一步证实了SETD8可以在各个阶段调控体外造血发育。     

HOXB6启动人胚胎干细胞向中胚层分化

HOXB6在胚胎发育过程中发挥重要作用,但在人胚胎干细胞中胚层分化中的作用尚不清楚。该研究利用人胚胎干细胞中胚层分化模型结合RNA-seq分析发现,HOXB6在中胚层分化过程中显著上调,敲降HOXB6的表达抑制人胚胎干细胞向中胚层分化,提示HOXB6在中胚层分化过程中发挥功能。通过建立HOXB6诱导性过表达的人胚胎干细胞株发现,HOXB6过表达抑制人胚胎干细胞多能性标志分子的表达,并且显著上调中胚层标志分子的表达。该研究表明,HOXB6单独过表达能够启动人胚胎干细胞向中胚层分化,为理解人类早期发育和建立人胚胎干细胞高效诱导分化体系提供了理论依据。