黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。该文以黄河裸裂尻鱼肌肉总RNA为模板,采用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得MSTN基因全长cDNA序列为2180bp,包含长为1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸。以肌肉总DNA为模板,通过PCR法进一步获得了MSTN基因的2个内含子序列,分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN基因与其他脊椎动物具有相似的基因结构(包括3个外显子和2个内含子)。黄河裸裂尻鱼MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RXXR和8个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN序列与其他鲤科鱼类MSTN具有较高的同源性;而与哺乳动物和禽类的MSTN同源性较低。系统发育分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。RT-PCR分析表明,该基因在黄河裸裂尻鱼9个被检组织中均有表达,但在心、肾、肠、精巢中表达量较高。Real-TimePCR分析显示,MSTN基因在胚胎中的相对表达量,随胚胎发育阶段的不同而有所差异,暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用,可能还有其他功能。     

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。     

黄河裸裂尻鱼肥胖基因克隆及其对青藏高原季节性冷环境的适应性表达

目的克隆黄河裸裂尻鱼肥胖基因(obese gene,ob),分析编码蛋白leptin的序列特征,检测ob mR-NA的组织特异性表达和不同环境温度下肝胰脏和白肌ob mRNA的相对表达水平,为探究黄河裸裂尻鱼在青藏高原季节性寒冷环境下的生态适应机制提供科学数据。方法利用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得ob基因全长cDNA序列。通过已知cDNA序列设计半定量RT-PCR和real-time PCR引物,进行表达研究。结果黄河裸裂尻鱼ob基因序列全长为1 337 bp,其中开放阅读框(ORF)长513 bp,编码170个氨基酸。黄河裸裂尻鱼ob mRNA在心脏、肾脏、脂肪、肠、精巢、肝胰脏、鳃、脑和肌肉9个被检组织中均有表达,其中在心脏中表达最强,肌肉组织中表达最弱。栖息水域环境温度下降,将显著抑制黄河裸裂尻鱼肝胰脏和白肌ob mRNA的表达。结论黄河裸裂尻鱼ob基因特殊的组织表达特征可能与其特定组织的能量代谢及其特殊的生物学功能有关。Leptin在黄河裸裂尻鱼能量代谢调节和季节性环境适应方面发挥着重要作用。     

利用Cyt b基因序列探讨柴达木裸裂尻鱼的分类学地位

长期以来,柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)的分类学地位存在争议。为此,测定了柴达木裸裂尻鱼格尔木河及托素湖种群24个个体及黄河裸裂尻鱼(S.pylzovi)黄河及大通北川河种群12个个体的Cytb基因全序列。通过遗传距离和系统发育分析,探讨了柴达木裸裂尻鱼的分类学地位。结果显示,柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼在系统进化树上并未形成相应的单系群;柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼种间平均遗传距离为0.54%,明显低于裂腹鱼亚科其他属鱼类的种间遗传距离及本属其他种间遗传距离,表明来自柴达木盆地格尔木河和托素湖的裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼之间没有达到种级水平的显著分化。综合地质学资料和柴达木水系与黄河水系现今的隔离格局,建议将柴达木裸裂尻鱼作为黄河裸裂尻鱼的一个亚种,即S.pylzovi kessleri。     

黄河裸裂尻鱼群体遗传结构和Cyt b序列变异

测定了来自黄河上游和柴达木盆地托索湖的裸裂尻鱼共16个个体的Cytb基因全序列(1141bp),探讨了种群结构和遗传多样性。用MEGA2.1软件分析了碱基组成和序列变异;以青海湖裸鲤、花斑裸鲤和极边扁咽齿鱼为外类群,用PAUP*4.0b10程序构建了单倍型NJ树;用Arlequin Ver.2000程序计算了群体间遗传变异值(Fst)和Nm值以及群体分化概率值。结果显示,来自柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼没有形成单系群,Fst=0.204(P0.05),Nm=1.95。初步判断,黄河和柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼未显著分化,支持将柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)归并入黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)的形态学结果。两种群核苷酸多样度()分别为0.0012和0.0026,表现为较低水平。根据校正的分子钟推测,黄河和托索湖裸裂尻鱼群体分歧时间为距今7万年左右的更新世末期,结合地理分布的资料和古地质事件,对黄河裸裂尻鱼群体分布水系间的历史联系进行了分析。       

条件性RNA干扰技术研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由与靶基因同源的双链RNA引起的,具有序列特异性的转录后基因沉默技术。目前,RNAi已被广泛应用于基因功能的研究中。为了使基因沉默具有时空特异性,可以通过构建基于Cre重组酶的Cre/lox P系统、可被小分子药物诱导的Tet诱导系统以及两者组合形成的高级诱导RNAi系统来条件性的控制小发夹状RNA(sh RNA)的表达,使其靶基因的表达可受外界调控,在特定组织细胞中或者特定的生长发育时期被抑制,从而更好地进行基因功能研究。目前,条件性RNAi基因沉默策略具有多样化,精确性和组合式的特点。本文就条件性RNAi基因沉默技术的多元策略做一综述。     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼感染多子小瓜虫的病理学比较研究

为探讨不同裂腹鱼类感染多子小瓜虫后的病理学差异, 利用多子小瓜虫对青海湖裸鲤指名亚种(Gymnocypris przewalskii przewalskii)和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)实施感染实验, 并对2种鱼进行了深入的病理学研究。研究结果显示: (1) 2种鱼的死亡量均呈现先激增后明显回落的趋势, 青海湖裸鲤死亡高峰在感染后第3至第4天, 黄河裸裂尻鱼死亡高峰在第3至第5天, 青海湖裸鲤的死亡比黄河裸裂尻鱼急剧。(2)感染后2种鱼体表均出现大量肉眼可见的白点。青海湖裸鲤皮肤黏液分泌量明显增加, 体表形成胶状黏液层, 黏液层中见不同细胞期小瓜虫包囊。黄河裸裂尻鱼鳍出现蛀鳍现象, 皮肤出现细菌感染样溃烂。(3)解剖发现, 感染组青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼肝脏发生病理改变呈淡黄色, 胆有不同程度肿大。(4)组织切片和电镜观察显示, 小瓜虫在鳃部位的寄生导致青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼鳃丝黏连, 鳃小片和鳃丝上皮细胞萎缩、脱落, 鳃丝结构被严重破坏。小瓜虫在2种鱼皮肤的寄生使寄生部位组织突起, 周围组织塌陷。青海湖裸鲤表皮下层出现空隙, 表皮结构被严重破坏。黄河裸裂尻鱼皮肤表皮细胞出现空泡化病理改变, 失去原有紧密结构, 表皮层和固有层间界限变模糊。综上所述, 小瓜虫的感染对青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼的鳃和皮肤组织造成严重损伤, 但2种鱼表现的症状和造成的组织损伤类型有明显差异, 这与2种鱼长期适应不同水体环境密切相关。     

封闭EFNA2 基因表达对肝癌细胞HepG2 的转移和运动的抑制作用

目的:构建Ephrin-A2(EFNA2)基因的干扰RNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞HepG2转移能力的影响。方法:合成EFNA2基因的干扰RNA片段,用基因重组技术构建于腺病毒载体pAD-X,经293细胞包装得到高滴度重组腺病毒pAEFNA2/siRNA,并用real-time PCR进行EFNA2基因表达的验证。将重组腺病毒pAEFNA2/siRNA感染HepG2细胞,48h后用transwell小室法检测病毒对HepG2细胞侵袭和运动能力的影响。结果:经验证病毒正确构建,且HepG2细胞感染病毒pAEFNA2/siRNA后48小时的real-time PCR检测结果未见到有EFNA2基因的表达。病毒感染后transwell小室可见,HepG2细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(分别为105±12 v.s.21±7cells/孔和194±22 v.s.39±11,P<0.01)。结论:成功构建了重组EFNA2siRNA腺病毒,并观察到封闭EFNA2对肝癌细胞HepG2的侵袭和运动均有抑制作用。     

RNA干扰技术在哺乳动物中的应用

RNA干扰(RNAi)是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制.RNAi是由双链RNA触发的转录后基因沉默机制,具有序列特异性,在哺乳动物细胞中,RNAi由21～23个核苷酸组成的双链RNA引发.小干扰RNA(siRNA)可以在体外合成或通过表达载体在哺乳动物细胞内合成.由于RNAi技术具有快速、简单和特异性强等特点,在基因功能研究、抗病毒治疗和抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景.     

硬骨鱼类血红蛋白转换表达的新模式——以黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白研究为例

为了探讨高原硬骨鱼类胚胎型血红蛋白的转换表达模式, 研究利用转录组数据和克隆方法研究了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)胚胎型血红蛋白的组成和基因结构, 并通过qRT-PCR和整胚原位杂交方法确定了胚胎发育过程中血红蛋白基因的表达情况。结果表明, 黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白基因由hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3组成, 均包含3个外显子和2个内含子, 其中hbbe1/hbae1以“头对头”(3′-5′—5′-3′)转录方式串联在一起, hbbe3/hbae4则以“尾对尾”(5′-3′—3-5′)的转录方式串联在一起。进一步的研究初步判断hbae3、hbae5和hbbe2基因在裂腹鱼亚科鱼类进化过程中可能发生了丢失。qRT-PCR和整胚原位杂交结果均表明在早期胚胎发育过程中4个胚胎型血红蛋白基因的表达都是从受精后第5天(120 hpf)开始明显上升, 但是hbae4和hbbe3基因的高表达只维持在受精后第5天(120 hpf)至破膜期(216 hpf), 随后急剧下降, 而hbae1和hbbe1基因表达从破膜(216 hpf)开始急剧上升。研究揭示了硬骨鱼类一种全新的血红蛋白转换表达模式, 这可能与黄河裸裂尻鱼特殊的进化历程和高原环境的适应有关, 研究结果将为进一步深入研究硬鱼类血红蛋白的时序转换表达和环境适应机制奠定基础。     

RNA干扰技术及其在肝纤维化中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术,是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,因而抑制相应基因表达,导致转录后基因沉默的现象.尽管RNA干扰发现的时间较短,但由于其具有操作简单、成本低、特异性高和高效性等特点,因而发展迅速.小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的可制备使RNAi在很多领域有了应用的前景,尤其是在复杂多变的肝脏疾病中.肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是多种慢性肝病发展的共同病理基础,RNAi技术在其基因治疗领域拥有广阔的前景.RNAi具有能够调节细胞增殖、抑制致病基因的表达、影响细胞的信号转导等方面的作用,可能成为肝纤维化有效的潜在治疗手段.     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

人CD46 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:构建并筛选携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,从而特异、有效地抑制人CD46mRNA水平。方法:利用DNA重组技术,将2条60nt能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,并转化大肠杆菌JM109。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确。结论:特异性沉默CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体构建成功,为后续转染Jurkat细胞,研究CD46在T细胞的信号转导中的作用奠定了基础,对进一步研究T细胞相关疾病及开展细胞免疫缺陷的治疗方面提供了新的思路与方向。     

EGFL7 基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）重组慢病毒表达载体。方法：参照小分子干扰RNA 的设 计原则,应用OligoDesigner 3.0 软件设计三条靶向人EGFL7 基因的RNA干扰序列（hEGFL7-RNAi）,并将其分别插入含有绿色 荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLV3 中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE 和pMD2G共同转染293T细胞,包 装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR 检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后靶基因mRNA 的水平,以评价 其基因沉默效果。结果：筛选出3 条人EGFL7 基因的RNAi 序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1× 108、2× 108和5× 108TU/mL,将其转染入HUVEC 后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论：成功筛选出三条针对人EGFL7基因的 RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs 中EGFL7 基因的表达。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

干扰MDR1基因表达提高急性早幼粒白血病HT9细胞对紫杉醇的敏感性

以人类急性早幼粒白血病HT9细胞为实验对象,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术干扰MDR1基因表达,提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性。构建了3种靶向MDR1基因的重组干扰载体,稳定转染HT9细胞后,采用qRT-PCR和Western blotting方法,分别检测MDR1基因的m RNA和蛋白表达水平,用MTT法检测各转染组细胞对紫杉醇的敏感性,流式细胞术检测各组细胞药物外排功能。结果显示,成功构建了3种靶向MDR1的重组干扰载体p3.1-1、p3.1-2和p3.1-3。3种重组干扰载体不同程度抑制HT9细胞中MDR1基因的表达,其中重组干扰载体p3.1-3对MDR1基因沉默效果最好,对m RNA和蛋白的沉默效率分别为73.80%和47.61%,与对照组相比,转染p3.1-3重组干扰载体的细胞对紫杉醇的IC50由(1.26±0.17)μg/m L降至(0.46±0.07)μg/m L,逆转率达到(63.48±5.91)%,并且药物外排功能也明显降低。以上实验结果表明,3种靶向MDR1的重组干扰载体均能抑制MDR1基因表达,其中p3.1-3对MDR1基因干扰效果最好,并且能够有效提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性,降低细胞药物外排功能。     

RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(ds RNA)诱导同源靶基因的m RNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。本文综述前人的研究结果,系统阐述了RNA干扰的发现、特征以及试验方法,为相关科学研究提供参考。