绿木霉SM1蛋白诱导拟南芥防御反应以及激发活性氧途径研究

SM1蛋白是由绿木霉Trichoderma virens产生的一种富含半胱氨酸的小蛋白,能够作为激发子激发植物防御反应。研究了SM1蛋白对拟南芥Arabidopsis thaliana生长及诱导抗性的作用。结果表明高浓度（>10μg/mL）SM1蛋白液抑制拟南芥的生长,低浓度SM1蛋白液则不影响生长;SM1能诱导拟南芥对细菌性叶斑病Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000的抗性,引起拟南芥叶片过氧化氢的积累。SM1蛋白处理后,拟南芥叶片中植物防御反应相关基因PDF1.2、LOX2和活性氧酶基因 SOD、POD等表达显著上升,说明SM1在激活植物的JA/ET和ROS途径中发挥着重要作用。研究为进一步研究SM1诱导植物抗性的机理提供了基础。     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响

以哥伦比亚生态型(Columbia-0)的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为实验材料,分别采用12.96KJ.m-2.d-1、17.28 KJ.m-2.d-1、21.60 KJ.m-2.d-1三种不同的UV-B剂量对9日龄拟南芥幼苗进行辐射处理,然后对微管蛋白进行纯化,通过紫外分光光度计和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳初步研究了增强UV-B对不同处理组微管蛋白的影响,进一步用免疫印迹鉴定微管蛋白并比较不同处理组微管蛋白差异。结果表明,增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的含量有影响,与对照相比,不同剂量UV-B辐射处理组微管蛋白含量呈先增加后减少的变化趋势。     

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.     

拟南芥细胞壁关联蛋白激酶融合表达及多克隆抗体的制备

为了研究拟南芥中细胞壁关联蛋白激酶1(WAK1)基因功能,通过RT-PCR得到WAK1 cDNA片段,将其亚克隆至pET28a表达载体中进行表达,获得融合蛋白.用纯化的融合蛋白pET28aWAK1免疫家兔,得到抗WAK1抗体.Western blot结果显示该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,抗WAK1的抗体对拟南芥中的WAK1蛋白具有高度的特异性.     

拟南芥LFR原核重组蛋白纯化和多克隆抗体制备

拟南芥中有一类含ARM结构域的蛋白质,研究表明它们中的一些在植物的生长发育和激素应答等方面发挥着重要的作用.在拟南芥突变体筛选中,获得了一个推测编码蛋白含ARM重复序列的新基因突变体lfr(leaf and flower related mumnt),它在叶子和花的发育过程中表现出较明显的表型.为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,构建了pGEX-2TGST:LFR融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS.聚内烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子质量在77 ku左右.重组蛋白经谷胱甘肽S.转移酶(GST)标签蛋白亲和层析法纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取拟南芥野生型及突变体的核蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示,在分子质量50ku左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.     

asr基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定

为研究asr作用的分子机制,分析该基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白,分别构建诱饵质粒载体和转基因拟南芥cDNA文库,通过转入酵母细胞中,初步的鉴定分析证实成功构建了诱饵质拉载体和拟南芥cDNA文库.构建的酵母双杂交系统为发现asr基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础.     

拟南芥AtTERT对大肠杆菌非生物胁迫抗性的影响

端粒酶是真核生物中维持染色体末端DNA完整性的一类特殊逆转录酶,研究拟南芥AtTERT对大肠杆菌生长及非生物胁迫的影响,为深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基础.将拟南芥AtTERT转入大肠杆菌,成功构建pET32a-AtTERT原核表达载体,优化诱导条件,纯化并鉴定GST-AtTERT融合蛋白,运用Western b...     

定位于类囊体膜的PPF1在转基因拟南芥中的表达影响叶绿体的发育

PPF1是一个与植物营养生长相关的基因.它编码的产物可能是一个膜蛋白并与拟南芥叶绿体中的类囊体蛋白ALB3有很高的同源性.免疫电镜分析表明PPF1蛋白同样主要定位于类囊体膜,而且在短日照G2豌豆开花两周后仍发育良好的叶绿体中有很高的表达,在长日照豌豆同时期非正常叶绿体中丰度非常低.对转基因拟南芥和野生型植株的叶片衰老进程比较发现, PPF1在拟南芥中的过量表达可以延缓叶片的衰老,而用PPF1反义mRNA抑制拟南芥中的同源基因ALB3则明显加快叶片衰老速度.对转基因拟南芥的超微结构分析显示,PPF1在拟南芥中过量表达时,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体大并含有更多的基粒和基质类囊体膜;相反,反义PPF1表达抑制其在拟南芥中的同源物时,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体小并含有较少的基粒和发育较差的类囊体膜系统.这些数据表明叶绿体的发育状况与PPF1或拟南芥同源物ALB3的表达水平呈正相关.我们的结果提示PPF1基因可能通过控制叶绿体的发育状况来调节植物的发育.     

拟南芥Antiquitin基因的原核表达和生物信息学分析

将拟南芥Antiquitin基因重组到原核表达载体pMAL-c4x和pET41中,在T7 Express菌株中诱导表达,经Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白.SDS-PAGE结果表明:MBP和His-tag融合的拟南芥Antiquitin主要以可溶性形式存在,表达量分别占细胞总蛋白的25.1%和39.4%.以乙醛和NAD~+为底物测定融合蛋白活性,结果显示:His-tag融合的Antiquitin具有醛脱氢酶活性,比活力为8.98 U/mg,乙醛的表观K_m和V_(max)值分别为0.98 mmol/L和12.75 U/mg.序列比对和结构预测结果显示:拟南芥Antiquitin包含该家族蛋白典型的催化结构域、NADH结合结构域和寡聚化结构域,活性中心残基为Gly238、Gly291、Glu391、Phe393.