转基因水稻中转录水平crylAb基因的沉默及其阶段复活

以田间环境释放条件下农杆菌介导法转化而成的转crylAb基因水稻为研究对象,利用GUS组织化学染色法、Western杂交技术,在不抗虫转基因中8215株系后代中筛选到一个无Cry1Ab蛋白表达产物株系.分子杂交结果证实,转基因crylAb在中8215株系后代中发生了转录水平沉默,整合过程中基因重排使两个拷贝的ubiquitin启动子同时插入到水稻基因组中.甲基化分析证实ubiquitin启动子区域发生了甲基化,从而导致crylAb基因沉默.利用去甲基化试剂5-氮胞苷处理转基因沉默水稻种子,并在苗期、分蘖期、孕穗期、灌浆期及成熟期检测了其对沉默基因的复活效应,结果表明:5-氮胞苷处理使沉默的crylAb基因在灌浆期恢复表达活性,复活率约为8%～30%,且以低浓度(45 mg/L处理1,2 d)处理的复活率及恢复表达水平较高,复活基因表达的Cry1Ab蛋白最高可达可溶性总蛋白的0.147%.     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

水稻bZIP蛋白REB结合Wx基因启动子中的GCN4基序

在水稻Wx基因启动子中找到了一个由胚乳基序(EM)和GCN4基序组成的双元胚乳盒. 许多文献报道,种子贮存蛋白基因启动子中的胚乳盒与基因的种子专一性表达有关,一类bZIP家族的转录因子通过结合胚乳盒中的GCN4基序而调控相应基因在种子中专一性表达.本文证明了水稻Wx基因启动子的胚乳盒中的GCN4基序能被水稻未成熟种子中的核蛋白识别并结合.进一步采用PCR的方法克隆了水稻bZIP家族的转录因子——REB的部分cDNA,并在E.coli中表达了REB融合蛋白.凝胶滞后试验结果表明,除文献报道,REB能结合α-globulin启动子上的靶位点外,REB也能识别并结合水稻Wx基因启动子的GCN4基序.     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

转修饰cry1Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养,共接种花药2600枚,获得83份花培植株,其中双倍体植株43份,单倍体植株40份。 PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株55份,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为2∶1（55/28）。进一步结合Southern blot和ELISA分析,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系36份。外源蛋白表达量上,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致,最高的Cry1Ac含量达0.25%。田间抗虫性试验表明,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟(Chilo suppressalis)表现出高抗,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

一个棉花生殖器官优势表达基因的启动子功能分析

用棉花生殖器官优势表达启动子替代CaMV35S启动子是解决目前转基因抗虫棉存在“前期抗虫性强, 后期抗虫性弱”这一生产实践问题的关键. 运用反向PCR技术从陆地棉中分离到一个棉花生殖器官优势表达基因——腺苷酸核糖基化作用因子1 (Arf1)基因的启动子序列. 该启动子具有独特的结构特征, 不仅同时包含有转录起始子(initiator), TATA box, CAAT box和GC box这四种特异元件, 而且还包含有一个5′非翻译区的内含子. 通过构建四个启动子缺失突变体, 定向替换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子, 并与GUS基因融合, 构建了4个植物表达载体. 用花粉管通道技术将它们导入到棉花中, 转基因棉花后代的GUS染色和荧光定量分析结果表明: Arf1启动子是一个典型的棉花生殖器官优势表达启动子, 它为棉花生殖器官性状的分子设计和抗虫棉的再创新提供了有用的工具.     

小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

哺乳动物Bax基因在长春花细胞中的诱导表达及其对长春花生物碱合成的促进作用

Bax是哺乳动物细胞凋亡基因Bcl-2家族中的一员. 以往的研究报道表明, Bax基因可以诱发拟南芥等模式植物的超敏反应 (hypersensitive reactions, HR). 为了考查Bax基因对药用植物细胞次生代谢产物合成的影响, 我们构建了长春花雌二醇诱导型Bax基因工程细胞系. 实验结果表明, 转基因长春花细胞中Bax基因的表达水平对β-雌二醇浓度呈现明显的依赖性, 说明雌二醇诱导型启动子可以有效控制转基因长春花细胞中Bax基因的表达. 在30 μmol/L β-雌二醇处理下, 转基因长春花细胞中的长春花碱和总生物碱含量分别比野生型细胞高5. 0和5. 5倍, 表明哺乳动物Bax基因对长春花细胞中生物碱的合成具有促进作用. Northern blotting和Western blotting检测结果表明, Bax基因可以提高转基因长春花细胞中萜类吲哚碱生物合成途径关键酶基因Tdc和Str的转录水平, 并且促进细胞中防御相关蛋白PR1的积累, 说明Bax基因可以诱发长春花细胞的防御反应, 激活细胞中萜类吲哚碱生物合成途径, 从而提高长春花生物碱的合成代谢流量. 研究结果表明, 哺乳动物Bax基因可以从细胞水平上促进植物次生产物的合成, 为植物细胞次生代谢产物合成的分子调控提供了一种新的策略.     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种HD-133cry1D的表达调控

利用PCR扩增基因cry1D启动子及上游区片段,在测序的基础上构建含cry1DlacZ融合基因穿梭质粒,导入不同遗传背景的苏云金芽胞杆菌菌株中,并以cry1AblacZ融合基因为对照测定β半乳糖苷酶活性,检测启动子上游区的作用。结果表明,cry1DlacZ和cry1AblacZ融合基因在不同遗传背景的菌株中表达完全不同,也许一些宿主专一性的因子参与了转录调控;而在同一菌株中Ccry1DlacZ和cry1AblacZ的表达差异是由于上游区的不同以及竞争有限的σ因子所致。利用PCR定点诱变技术突变其SD序列GGGGA为GGAGG后,cry1DlacZ融合基因的表达提高了1.0～1.6倍。表明GGAGG是苏云金芽胞杆菌合适的SD序列,也揭示了不合适的SD序列是cry1D表达量低的原因之一。     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

水稻Rac家族新成员osRACB基因的克隆及结构分析

Rac基因是植物中惟一的一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 它在整个植物生长发育过程中起着极为重要的作用. 应用本实验室已有的水稻光周期育性转换相关基因osRACD为探针, 在低严谨杂交条件下, 筛选农垦58N-LD雌雄蕊形成期(第Ⅳ期)幼穗cDNA文库, 获得一水稻Rac家族新基因. 经同源性比较和序列分析显示, 该基因与玉米Rac家族成员RACB基因具有93%的核苷酸同源性, 且两者氨基酸序列长度相等, 仅存在一个氨基酸残基差异, 故命名新基因为osRACD. 进一步应用PCR技术, 以农垦58N基因组DNA为模板扩增得到长度为2930 bp的osRACB基因转录区核苷酸序列, 其结构包含7个外显子和6个内含子, 同时, 通过基因组文库筛选获得osRACB基因的启动区序列. Southern杂交分析表明osRACB基因同其他Rac基因相似, 是低拷贝基因. RT-PCR检测显示osRACB基因在水稻根、茎、叶中均有一定的表达, 但在茎中表达量最高. 此外, 还以人Rac1蛋白为模板, 利用InsightII软件包下的Homology, Discover等模块对osRACB蛋白进行了三级结构预测.     

用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除

绿色荧光蛋白(GFP)可直接进行活体观察,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此,构建了植物表达载体pGNG,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒(NosP-nptll-NosT)一起克隆在两个同向的lox位点间,在第一个lox位点上游置有CaMV 35S启动子以驱动GFP表达,第二个lox位点下游置有不含启动子的大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因。首先在含卡那霉素(Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草,借助绿色荧光可容易地检出表达GFP的转化体。然后用另一转化载体pCambia1300Cre二次转化表达GFP的转基因植物,利用另一选择标记基因潮霉素抗性基因(hpt)进行筛选,在获得的再生植株中,Cre重组酶的表达消除了转化体中两lox位点间的gfp和nptll。实验结果表明可借助GFP荧光的消失,快速选出nptII被消除的二次转化体,同时GUS(作为目的蛋白) 在CaMV 35S启动子驱动下获得表达。最后利用后代的分离将hpt和cre除去。     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8％,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab。根据cry2Ab基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab 完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

高效Bt抗虫基因表达结构的构建及其在转基因烟草中表达行为的研究

构建了高效植物表达载体pBinMoBc,其携带有超强表达复合启动子OM及Ω因子控制下的CryIA?基因,作为对照,本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的CryIA?基因的植物表达载体pBinoBc。分别使用两个植物表达载体转化烟草,ELISA检测表明,在pBinMoBc转基因烟草中CryIA?基因的平均表达水平是pBinoBc的2.44倍,最高可达可溶蛋白的0.255%。抗虫检测结果表明,pBinMoBc转基因烟草与pBinoBc转基因烟草相比,具有更强的抗棉铃虫效果。上述结果表明,OM启动子比CaMV 35S启动子更具有实际应用价值,此结果在植物抗虫基因工程研究中具有重要意义。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。