雌激素对成年和老年雌性大鼠血管平滑肌细胞雌激素受体α表达的影响及其机制

目的探讨雌激素对成年和老年雌性大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)雌激素受体α(ERα)表达的影响及其机制。方法采用RT-qPCR、Western blot及重硫酸盐修饰后测序(BSP)的方法,检测体外培养的3-4代成年(2-3月龄)和老年(≥20月龄)雌性SD大鼠VSMC在无或有生理剂量(10-10 mol/L、10-8 mol/L)17β-雌二醇(E2)存在下,ERα的表达及其启动子区CpG岛甲基化水平的变化。结果成年雌性大鼠VSMC无论在有或无雌激素存在时均表达ERα,且表达水平随雌激素浓度增加而上升。而老年雌性大鼠VSMC无论是在mRNA水平还是蛋白质水平几乎检测不到ERα表达,即使补充雌激素达最高生理剂量也无法诱导ERα的重新表达,其ERα基因启动区CpG岛呈现高水平甲基化。结论成年大鼠VSMC表达ERα,且生理剂量雌激素对其表达具有诱导作用。而老年大鼠VSMC ERα基因由于CpG岛已发生高度甲基化而抑制,生理剂量雌激素对ERα表达的诱导作用丧失。     

血管平滑肌细胞的钙动力学

血管平滑肌细胞外的Ca~(2+)通过多种通道进入细胞内。Ca~(2+)通道的本质是镶嵌在膜脂质双分子层中的糖蛋白,神经介质和药物可影响Ca~(2+)通道的功能。靠近胞膜的肌质网和胞膜内侧面的高亲和性Ca~(2+)结合位点是血管平滑肌细胞内储存和释放Ca~(2+)的主要部位。胞浆[Ca~(2+)]增高后在钙调蛋白的介导下引起血管收缩。高血压等血管性疾病的发生与其平滑肌细胞的钙动力学异常有关。     

血管平滑肌细胞的分化与血管内壁的构建

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的发育与血管壁的构建是目前相关领域中的重要学科前沿．国内外同行的工作多集中在血管发育初始阶段内皮细胞及其前体细胞在血管新生中的作用、调节因素及生物学机制．VSMCs参与血管壁早期构建,特别是VSMCs的募集与分化机制已经成为血管新生研究中的一个新领域． 本期发表的《 抑制Rac1蛋白活化阻碍胚胎发育早期血管新生 》(见696～701页)报道了韩雅玲教授及其合作者在这一领域取得的最新研究结果．Rac1是真核细胞内重要的一类信号传递分子,在细胞信号传递过程中发挥分子开关作用．他们采用胚胎干细胞(ESCs)为模型,建立稳定表达持续型Rac1和显性失活型Rac1编码序列的小鼠ESCs并制备胚胎小体,诱导分化后观察其对内皮细胞分化和迁移的影响,发现抑制Rac1可以干扰血管内皮细胞连接成血管网状结构,细胞骨架F-actin排列紊乱,细胞的迁移受到明显抑制,表明Rac1在胚胎早期血管发育过程中与内皮细胞的迁移有关[1]． 近年来,韩雅玲教授及其研究集体在VSMCs发育与血管构建、胚胎干细胞来源的拟胚体血管平滑肌发育与血管新生机制以及胚胎主动脉VSMCs起源等方面开展了研究,取得了一系列有价值的成果[2～11],可能为闭塞性和增生性血管病的发生及防治提供理论依据和候选基因．详见“相关链接”．     

心钠素对培养兔血管平滑肌细胞钙内流的影响

心钠素(ANP)是由心脏分泌的具有利尿利钠降压作用的循环激素,参与体内水、电解质平衡的调节,这一作用是由细胞内第二信使两cGMP介导的。近年来发现ANP可影响细胞钙转运,具有天然钙通道阻断剂样作用,可能参与细胞钙稳态调节,但其机理尚不清楚。本工作在培养兔主动脉平滑肌细胞(VSMC)上,观察ANP对内皮素(ET)及高钙引起的细胞钙转运的影响,以探讨ANP和细胞钙转运的关系。     

17β—雌二醇抑制内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖作用

目的和方法：利用组织块贴壁法进行大鼠VSMC培养,胰蛋白酶分散细胞法传代。实验采用第4-6代细胞。采用氚-胸腺嘧啶核苷（[^3H]-TdR)掺入和细胞计数来作为VSMC增殖的指标,以RT-PCR的方法检测ETAR的表达,观察17β-雌二醇（E2）对内皮素-I（endothelin-l,ET-1)介导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖反应以及对内皮素A型受体（ETAR）表达的影响。结果：ETAR特异性拮抗剂BQ123能完全阻断ET-1介导的VSMC增殖反应;E2可明显抑制ET-1促进VSMC增殖的作用,RT-PCR结果显示E2能抑制ETAR的表达,12h时抑制作用最为明显;E2受体阻断剂Tamoxifen亦能部分抑制ET-1对VSMC的增殖及ETAR的mRNA的表达。结论：ET-1促进VSMC增殖作用主要通过ETAR介导的,雌激素可通过抑制ETARmRNA表达来发挥对ET-1促进VSMC增殖的抑制作用。     

SM22α对血管平滑肌细胞骨架及收缩功能的影响

SM22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的标志蛋白,为了探讨该蛋白与VSMC表型和功能的关系,利用血清饥饿法诱导VSMC由合成型向收缩型转变,用RT—PCR对不同表型VSMC的SM22α表达活性进行检测,并通过转染反义SM22α表达载体,观察SM22α表达对VSMC细胞骨架和收缩功能的影响。结果显示,在VSMC由合成型逆转为收缩型的过程中,SM22α和平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscle α—actin,SMα—actin)的表达分别被显诱导和轻度上调,与此同时,细胞骨架由稀疏的网格状变成均匀、致密的束状,VSMC重新获得收缩功能。用反义SM22α抑制该基因表达后,血清饥饿诱导的VSMC细胞骨架重构受阻,乙酰胆碱刺激引发的细胞收缩消失。结果提示,SM22α参与VSMC细胞骨架的构成及调节细胞的收缩功能,对维持VSMC处于收缩表型具有重要作用。     

17β—雌二醇下调血管平滑肌内皮素A型受体的表达

为进一步探讨雌激素对心血管的保护作用,实验在双侧卵巢去势大鼠模型和培养的血管平滑肌细胞（VSMCs)上,观察17β－雌二醇（E2）对血管反应性及VSMCs增殖的影响,以RT－PCR和Western blot检测内皮素受体（ETAR）的表达,结果显示：去势雌性大鼠血管对内皮素（ET－1）的反应性明显增高,ETAR特异性受体阻断剂BQ123能完全阻断ET－1对VSMCs增殖的影响,E2能明显抑制ET－1对VSMCs增殖的作用,RT－PCR结果显示E2能抑制ETAR mRNA的表达,Western blot进一步证实E2能抑制ETAR蛋白表达,E2受体阻断剂Tamoxifen能部分抑制ET－1对VSMCs的增殖及ETAR的mRNA和蛋白 的表达。以上结果提示;ET－1促VSMCs增殖的效应主要是由ETAR介导的,雌激素能通过下调ETAR来抑制ET－1对VSMCs 促增殖的作用和血管对ET－1的反应,且此作用与雌激素受体有关。     

脂多糖对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶基因表达及细胞增殖的影响

应用ＲＮＡ迷分析和亚硝酸盐含量测定检查脂多糖（ＬＰＳ）对大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）一氧化氮合酶（ＮＯＳ）基因表达及ＮＯ合成的影响,用Ｔ３Ｈ－ＴｄＲ参入实验观察ＬＰＳ对细胞ＤＮＡ合成的影响,结果表明,ＬＰＳＤ 诱导ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ表达和促进ＮＯ合成的同时,抑制ＶＳＭＣＤＮＡ合成,证明ＬＰＳ的作用与其浓度和作用时间有关。     

氨氯地平对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞生长的影响

本文采用自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）动脉平滑肌细胞培养,３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）和３Ｈ－亮氨酸（３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ）掺入方法,观察到用氨氯地平（Ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）作用４８小时后,与神经肽Ｙ（ＮＰＹ）组比较,其离体培养的ＳＨＲ动脉平滑肌细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入量降低５０．５％,３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入量降低５６．５％。氨氯地平组与对照组比较其３Ｈ－ＴｄＲ和３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入量分别降低５７．６％和３２．３％。用ＮＰＹ作用２４小时后,与对照组比较动脉平滑肌细胞３Ｈ－ＴｄＲ和３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入量却分别增加２０％和５４．６％。而细胞计数均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结果表明,氨氯地平能有效地抑制ＳＨＲ血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的ＤＮＡ和蛋白质合成,以及显著的抑制ＮＰＹ引起的ＶＳＭＣ的ＤＮＡ合成和蛋白质合成增加效应。提示氨氯地平在阻遏高血压致心血管壁肥厚的发生发展中起着不容忽视的作用     

基底膜拉伸应变对培养的大鼠血管平滑肌细胞形态的影响

目的：探索拉伸应变与血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）形态变化的关系,了解ＶＳＭＣ在血管壁对应力适应性改建中的响应。方法：运用自行研制的基底膜伸张装置实验系统,通过液压工作对培养于硅胶膜上的ＶＳＭＣ施以不同强度或不同时间的应变影响,模拟生理应力微环境中ＶＳＭＣ受到的二维伸应变,结合显微形态观察,计算机图像处理,了解拉伸应变与ＶＳＭＣ形态变化的定量关系。结果：（１）加载３ｍｉｎ－６ｈ内ＶＳＭＣ铺展进行性增加     

高压力对体外培养动脉中膜平滑肌细胞增殖及增殖相关蛋白和生长因子的影响

为了探讨力学因素在血管重建中的作用和机制,观察在单纯高压力条件下血管平滑肌细胞增殖及其相关蛋白和生长因子的变化。应用血管体外应力培养系统,在施加单纯压力的条件下培养猪颈总动脉。按压力大小,将培养的血管分为高压力(21．3kPa)组和正常压力(13．3kPa)组。两组血管均分别培养1、4和7d。免疫组织化学检测血管中膜平滑肌细胞的α-肌动蛋白,增殖细胞核抗原、血小板源性生长因子A、转化生长因子13l及P53蛋白的变化。结果显示：在高压力的作用下,随着培养时间的延长,α-肌动蛋白呈减少的趋势;增殖细胞核抗原,转化生长因子131、P53持续增多;血小板源性生长因子A先增加而后有所减少。说明高压力可明显促进血管平滑肌细胞表型的转变,发生增殖现象。提示高压力可能通过调节血小板源性生长因子A、转化生长因子131及P53蛋白的表达来调控血管平滑肌细胞的增殖。     

苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨苯扎贝特对体外培养的牛血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖的影响,以及可能的信号转导通路.方法采用改良的贴块法培养小牛胸主动脉VSMC,α-actin单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定培养细胞.以MTT法反映VSMC增殖情况;用Westem Blot方法检测与细胞增殖有关的丝裂原激动蛋白激酶(MAPK)信号传导通路.结果苯扎贝特呈剂量依赖性抑制VSMC增殖,其抑制增殖的作用主要是通过MAPK传导途径.结论苯扎贝特通过抑制VSMC增殖可能参与延缓动脉粥样硬化及经皮冠状动脉腔内成行术(percutaneous transluminal coronaryangioplasty,PTCA)术后再狭窄的发生、发展.     

切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞PDGF-B含量的变化

目的：探讨切应力作用下联合培养的血管平滑肌细胞(VSMC)对内皮细胞(EC)PDGF-B含量变化的影响,为组织工程血管和预防血管移植物再缩窄研究提供一些实验资料。方法应用免疫细胞化学方法和图像分析技术,以静态条件下单独培养的EC和联合培养的EC为两对照组,研究了切应力作用下单独培养的EC和与VSMC联合培养EC的PDGFB含量的变化。结果：静态条件下联合培养EC的PDGF-B的含量比单独培养的EC减少;切应力作用下,联合培养EC的PDGF-B含量在切应力作用1h左右有瞬时上升,随后下降至低于联合培养条件下的静态水平,且瞬时上升的时间点比单独培养的EC提前。结论：切应力作用下,与VSMC联合培养EC的PDGF-B含量下降,这可能有利于抑制VSMC的增殖,提示在组织工程血管构建时VSMC与EC联合种植有利于预防血管移植后的再狭窄     

壳聚糖和明胶材料对血管平滑肌细胞的作用

壳聚糖是一种具有发展前景的生物材料。研究了不同脱乙酰度壳聚糖、明胶及壳聚糖与明胶共混材料对血管平滑肌细胞生长的促进作用。在不同材料上培养细胞,采集培养后第1天和第5天的图像．在培养24、72、120h时做MTT实验。此外,还用酶联免疫检测(ELISA)方法测量了材料吸附细胞外基质蛋白的数量,探讨细胞外基质蛋白在血管平滑肌细胞与材料相互作用中所起的作用。结果表明脱乙酰度高的壳聚糖材料能较好地促进血管平滑肌细胞的粘附、铺展和生长,可能是一种具有一定应用前景的血管组织工程研究用材料。     

自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的精氨酸转运和脂质体对转运的影响

本工作在培养的自发民生高血压大鼠和对照ＷＫＹ大鼠的主动脉平滑肌细胞上,观察细胞Ｌ－精氨酸转动转征,并观察脂质体作为Ｌ－Ａｒｇ载体对Ｌ－Ａｒｇ细胞转运的影响。     

蛋白激酶C参与缺氧预处理的血管平滑肌细胞保护

已知缺氧预处理不仅对心肌细胞,而且对血管床亦有保护作用;但对血管壁细胞是否有直接保护作用,目前尚不清楚。本工作在培养的家兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）缺氧复氧（Ａ／Ｒ）损伤模型上观察缺氧预处理（ａｎｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ,ＡＰＣ）的影响。发现ＡＰＣ能提高Ａ／Ｒ后ＶＳＭＣ存活率,减轻细胞脂质过氧化损伤和钙超载,使用蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激动剂ＰＭＡ能模拟,而抑制剂Ｈ７或ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ能完全消除ＡＰＣ的上述保护作用。提示ＡＰＣ对ＶＳＭＣ的Ａ／Ｒ损伤具有保护作用,其机理可能与ＰＫＣ激活有关     

粉防己碱抑制血管平滑肌细胞增殖及对HSP70和p53表达的影响

目的：观察粉防己碱（Ｔｅｔ）对ＶＳＭＣ增殖的作用及对热应激蛋白７０ｋｄ（ＨＳＰ７０）及其ｍＲＮＡ和抑癌基因ｐ５３ｍＲＮＡ的影响。方法：用内皮素建立培养的血管平滑肌细胞增殖模型。采用氚－胸腺嘧啶核苷（［３Ｈ］ＴｄＲ）掺入法流式细胞术,Ｗｅｓｔｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交方法。结果：Ｔｅｔ能逆转内皮素所致的［３Ｈ］ＴｄＲ掺入量增多（Ｐ＜０．０１）,阻止血管平滑肌细胞由静止期（Ｇ０／Ｇ１期）进入ＤＮＡ合成期（Ｓ期）和有丝分裂期（Ｇ２／Ｍ期）,并能逆转内皮素引起的ＨＳＰ７０及ｍＲＮＡ表达增强（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）,ｐ５３抑癌基因ｍＲＮＡ表达减弱（Ｐ＜０．０５）。结论：Ｔｅｔ能抑制血管平滑肌细胞增殖,与ＨＳＰ７０及ｐ５３的调控有关     

内皮素对离体大鼠主动脉及主动脉平滑肌细胞作用的研究

本研究着重探讨内皮素对大鼠主动脉的收缩作用及对主动脉平滑肌细胞细胞周期及能量代谢的影响。浓度为1.0～18.0nmol/L的内皮素可引起大鼠主动脉产生浓度依赖性收缩,其EC_(50)为3.75±0.75nmol/L。正常对照组中平滑肌细胞S G_2M期细胞的比例基本稳定在26.3％～29.6％的范围内;浓度为10.0和1000.0pmol/L的内皮素可使S G_2M期细胞比例明显增高,上述变化呈良好的浓度依赖性(P<0.01);内皮素作用3～24h,随作用时间延长,S G_2M期细胞比例逐步增多,呈明显的时间依赖性(P<0.01)。10.0pmol/L的内皮素作用10min后ATP含量增至对照组的139.05±1.11％(P<0.01);20min后ATP含量为对照组的65.25±5.09％(P<0.01),低于对照组水平。结果表明,内皮素具有缩血管作用及促平滑肌细胞增殖作用,上述作用可能在高血压的发病机制中有一定的意义。     

反义CD151基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法构建携带全长正义和反义CD151的真核表达载体pcDNA3.1-CD151和pcDNA3.1-anti-CD151重组质粒,转染体外培养的VSMCs,以RT-PCR和Western blot方法检测CD151的表达,用Boyden趋化小室方法观察细胞迁移。结果与载体对照组、脂质体对照组和空白对照组3组均值比较,转染48h后,反义CD151组mRNA表达降低58%,蛋白表达降低51%,正义CD151组的VSMCs CD151mRNA表达增加171%,蛋白表达增加133%;趋化迁移的细胞数,反义CD151组为37.9±6.3,正义CD151组为86.5±12.4;载体对照组、脂质体对照组和空白对照组分别为60.3±7.1、61.8±7.6和67.3±9.6。反义CD151组显著低于其余各组(P<0.01),正义CD151组显著高于其余各组(P<0.01)。结论pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151转染,通过抑制CD151的表达,能够显著抑制大鼠VSMCs的迁移。