转基因白桦杂交子代种子活力及外源基因遗传规律分析

探索目的基因在转基因白桦杂交子代群体中的传递规律,为后续进一步跟踪调查,实现转基因白桦的聚合育种提供帮助。以1年生BpAP1、TabZIP转基因白桦杂交T1代和5年生BpGH3.5、BpCCR转基因白桦为研究对象,测定杂交子代种子千粒质量、发芽率和发芽势等活力指标,同时采用PCR扩增法检测目的基因,调查杂交T2代白桦苗高。杂交子代各家系间种子千粒质量、种子活力指标和苗高等在0.01水平上差异显著,各性状的家系遗传力均高于85.00%。研究结果表明,目的基因在T2代群体中的传递规律不符合孟德尔遗传规律,雌、雄配子目的基因的传递效率分别为30.00%、50.00%左右,同时未获得3目的基因聚合的杂交T2代个体。目的基因的随机插入降低了白桦杂交T2代种子活力,未获得3基因聚合的白桦杂交子代,目的基因的聚合对杂交子代个体的生长发育产生了不利影响,甚至产生致死现象。     

转基因欧洲黑杨中Bt基因表达特性的研究

利用PCR检测了转基因欧洲黑杨当代和杂交后代群体 ,外源Bt基因在 7年生的转基因欧洲黑杨 1 4个无性系中稳定存在 ,Bt基因在杂交后代中分离比例为 1∶1。转基因欧洲黑杨作母本进行杂交时有落花、落果现象 ,可能是基因改造影响了它们的某些生理功能。     

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因,构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经PCR斑点杂交和Southern杂交检测验证,获得4只转基因阳性小鼠,其中3只母鼠哺乳期收集乳汁,经EpoELISA检测为阳性。对4组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠,经PCR和Southern杂交分析,又鉴定出6只获得遗传的阳性G1代母鼠以Dot-ELISA的方法检测,其中两只G1代母鼠乳汁中的Epo含量为0.5μg/mL。实验证实,867bp的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

过表达钾转运蛋白基因trkH提高玉米的钾营养

钾是植物生长发育必须的营养元素,参与多种生理生化过程。土壤缺钾严重影响了玉米的产量和品质,通过遗传改良的方式提高玉米的钾营养是解决这个问题的有效途径。本实验室前期从海洋微生物宏基因组DNA中克隆得到细菌钾转运蛋白基因trkH,在酵母和烟草中验证了功能。为进一步分析trkH基因在玉米中的功能,以Hi-Ⅱ基因型玉米为转化受体,采用农杆菌介导法将trkH基因转入玉米,获得具有Baster抗性的独立转化苗21株。PCR检测结果表明trkH基因已成功转入到玉米基因组中。Bar试纸条检测结果表明Bar基因在蛋白水平上成功表达。将部分T₀代转基因植株与玉米骨干自交系PH6WC杂交,获得8个T₁代株系,半定量RT-PCR检测结果表明转基因植株在转录水平上均能表达。三叶一心期喷洒除草剂进行筛选,选择比例接近1：1的L3、L5和L7转基因株系进行PCR检测,统计检测结果并进行χ²测验,结果表明符合孟德尔分离定律。L3、L5和L7转基因株系玉米苗期的钾耗竭实验结果表明过表达trkH基因能够提高转基因玉米的K⁺吸收,为培育钾营养高效玉米新品种奠定基础。     

转IL-4基因大白菜后代的分子检测及遗传分析

采用PPT抗性筛选、PCR扩增、PCR-Southern杂交、ELISA、Western杂交等方法,对花粉管通道法介导IL-4基因转化大白菜的后代进行了分子生物学检测,同时结合统计分析手段研究了IL-4基因在转基因大白菜后代中的遗传规律.结果表明:(1)PPT抗性的转基因大白菜,T4代植株PPT抗性的阳性率为33.43％,IL-4基因PCR扩增的阳性率为1.39％.IL-4的分离情况不符合孟德尔分离定律.(2)对T4代5个株系的14个PCR阳性株进行ELISA检测,其中有7份样品为阳性,IL-4表达量约为326.87 ～ 1233.13 ng/g FW,同一株系内各株间IL-4的表达量差异显著.(3) Western杂交进一步证实IL-4在转基因大白菜后代中能正常表达.PCR-southern杂交表明IL-4基因已整合到大白菜基因组中,且在转基因后代植株中仍然存在.     

利用脉冲电泳技术转化玉米获得转基因植株的研究

本研究采用脉冲电泳技术将外源Bar基因和B-t基因转化玉米种胚并直接成苗,通过除草剂抗性初步筛选,再进行PCR检测、Southem杂交验证,探讨了脉冲电泳介导外源基因直接转化玉米种胚的有效性,结果表明：脉冲电泳技术介导玉米转基因是有效可行的,其T0代植株PCR阳性率与T1代植株转化率分别为11．36％和1．04％。在外源基因的转化中,处于不同启动子下的B-t基因和Bar基因共转化频率为90．9％。T1代PCR表现为阳性的植株Southem杂交结果显示脉冲电泳法介导的外源基因在受体中多为单拷贝,且已遗传给后代,并获得稳定表达。     

卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥中反式失活系统的建立

以细菌Xanthobacter autotrophicus卤代烷烃脱卤酶基因为遗传负选择标记,建立了该基因在拟南芥中反式失活的实验系统,在卤代[烷烃脱卤酶转基因的拟南芥中,有1株表现为转基因失活,离体核run-off转录实验表明为基因转录后沉默（这里特指沉默位点）,用这一转基因沉墨植株与同源转基因高效表达植株（这里特指同源转基因位点）杂交,结果96％的F1代植表现为同源基因反式失活,将F1代植株自交,使部分沉默位点与反式失活的同源转基因位点分离,结果200株子代中有42株表现DhlA活性,158株无DhlA活性,即 dhlA沉默植株与表达植株之比为3．76：1,表明沉默位点是以孟德尔显性因子方式使同源转基因位点反式失活的。     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具.方法 利用Cytomegalovirus( CMV)启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况.PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的.结果 显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应.结论 成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物.     

转水稻粗缩病毒运动蛋白缺陷型基因玉米的二重PCR检测研究

本研究以外源基因（RDV MP-）和玉米内源基因Zein作为PCR扩增对象,旨在建立一种简便有效的转基因玉米及其产品的二重PCR检测技术。转外源基因（RDV MP-）材料的常规PCR检测结果证明外源基因在转基因材料中可稳定遗传;对常规PCR检测的阴性结果材料进行二重PCR检测,扩增结果除进一步证实常规PCR检测的阴性结果结论外,还证明提取的植物总DNA质量符合试验要求,进而从二重PCR检测结果还得出常规PCR检测的阴性结果出错率为1.4%。此方法简单,实用,结果可靠,可适用于转基因植物及产品的检测。     

转基因小麦株系后代遗传稳定性的快速确证

转基因材料的遗传稳定性是基因工程成败的关键内容之一,快速确证其多代遗传特性是进行大量后代材料分析的技术保证。该文主要研究了从半粒转基因小麦B73-6-1种子中提取小麦基因组DNA的方法,并利用多重PCR技术以提取出的DNA作为模板对外源基因进行扩增,从而鉴定外源基因的遗传特性。对提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,实验结果表明,提取出的DNA产量和质量较高,而PCR的结果表明,所研究的方法可以同时扩增出两个外源基因,并利用该方法快速确证了转基因小麦B73—6—1外源udiA基因和bar基因的遗传稳定性。     

染色体重组对转基因大麦中gfp基因表达的作用

利用5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料,对不同转基因株系间以及转基因株系与野生型植株间进行杂交,分别对不同世代植株的根尖、花粉中gfp基因的表达量进行测定.结果表明,不同转基因株系间的根尖、花粉的gfp基因在表达量上存在差异,同一转基因材料的gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显性基因以孟德尔方式稳定遗传,不同染色体上的gfp基因重组有利于提高持基因表达.     

转SOD基因烟草中SOD酶活力对逆境的耐性及其遗传学特征

温度、pH、酶抑制剂H2O2和KCN均对转SOD基因烟草及其子代(S1和F1)的SOD活性有影响。在这些不利条件下,转基因SOD高表达烟草品系的SOD耐性明显优于对照品系,且其S1、F1能很好地保持亲本的这种优势。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

TA29-barnase基因转化菜心

利用根癌农杆菌导入法, 以菜心带柄子叶为外植体, 对TA29-barnase基因转化菜心进行研究。获得转化植株,进行PCR、Southern blotting杂交和半定量RT-PCR检测, 表明目的基因已经整合到转化植株中, 并且目的基因在转基因植株花蕾中得到表达, 但是表达水平在不同转基因植株间存在差别; 转基因植株开花后, 均表现雄性不育, 不能产生花粉或产生没有活力的少量花粉, 自交不能结实; 用未转化植株正常花粉对雄性不育植株进行授粉, 能够正常结实; 保持系(未转化植株)与不育株杂交后代中雄性不育株与可育株的比例为1:1, 在杂交后代植株子叶期, 喷洒10 mg/L的PPT可以完全杀死可育株; 利用其他菜心品种为父本与不育株进行杂交, 获得的F1植株在生长势和产量方面表现优势, 表明开展菜心优势育种具有一定的潜力。     

TA29-barnase基因转化菜心

利用根癌农杆菌导入法, 以菜心带柄子叶为外植体, 对TA29-barnase基因转化菜心进行研究。获得转化植株,进行PCR、Southern blotting杂交和半定量RT-PCR检测, 表明目的基因已经整合到转化植株中, 并且目的基因在转基因植株花蕾中得到表达, 但是表达水平在不同转基因植株间存在差别; 转基因植株开花后, 均表现雄性不育, 不能产生花粉或产生没有活力的少量花粉, 自交不能结实; 用未转化植株正常花粉对雄性不育植株进行授粉, 能够正常结实; 保持系(未转化植株)与不育株杂交后代中雄性不育株与可育株的比例为1:1, 在杂交后代植株子叶期, 喷洒10 mg/L的PPT可以完全杀死可育株; 利用其他菜心品种为父本与不育株进行杂交, 获得的F1植株在生长势和产量方面表现优势, 表明开展菜心优势育种具有一定的潜力。     

T—DNA插入水稻群体中卷叶突变体R1—A2的遗传分析

在根癌农杆菌介导的T-DNA(携带有除草剂Basta抗性基因bar和Ds因子)转化中花11水稻群体中,获得了一个叶片发生明显内卷的突变体Rl-A。经过连续三代的分离鉴定,获得突变体的纯合株(Rl-A2),并与中花11号进行杂交,在调查的36个F1植株中,全部表现为卷叶,并对Basta除草剂都表现为抗性。在852个F2单株中,卷叶为645株,正常叶207株,卷叶和正常叶的比例为3：1,其中,卷叶株均对Basta表现抗性,正常叶株均对Basta表现敏感,表明卷叶性状和Basta抗性存在着共分离关系。用扩增DS因子的引物,对F2中45个卷叶抗性株进行PCR鉴定,都获得预期长度的Ds因子片段,进一步表明在这些卷叶的植株中都有T-DNA的插入;而30个正常叶敏感株都不能检测到DS的特征片段。在以卷叶突变(Rl-A2)为回交亲本的F1B1植株中,全部植株表现卷叶;在以中花11号为回交亲本的F1B1植株中,卷叶和正常叶植株的分离比为1：1。上述结果表明该卷叶突变是个显性突变,受一个基因所控制,且该基因的突变与T-DNA的插入有关。