STING信号通路的研究进展

干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon gene, STING)作为固有免疫系统的关键性接头蛋白,在外源或内源DNA介导的免疫应答中发挥重要作用,广泛参与宿主体内的多种信号传导过程。概述了STING信号通路分子机制及其在抗病毒感染、自身免疫疾病、神经系统疾病和肿瘤中的作用,介绍了常见的STING激动剂和抑制剂,以期为STING的进一步研究提供参考。     

紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL的克隆及功能分析

FTL(F-box Triple LRR protein)是F-box蛋白家族的成员,具有F-box保守结构域,在植物抵御逆境胁迫过程中起重要作用。本研究参考低温胁迫下紫花苜蓿转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsFTL基因,该基因的全长1422 bp,编码473个氨基酸。该蛋白含有1个F-box结构域及3个LRR重复。系统进化分析表明,MsFTL与蒺藜苜蓿XP_003626345.1 F-box/FBD/LRR-repeat protein亲缘关系最近。两者蛋白序列比对发现共有11个差异位点。在低温、盐、干旱以及外源ABA处理下,MsFTL基因受到诱导,表达量上调。构建植物过表达载体pCBM-MsFTL,通过农杆菌介导法转化烟草。对经过抗性筛选、PCR和Real-time PCR验证的转基因植株进行低温抗性鉴定。在-4℃低温胁迫下,野生型烟草叶片出现了明显的萎蔫失水现象,而转基因烟草萎蔫程度相对较轻。生理检测结果表明,4℃处理24 h之后,转基因烟草的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性,CAT活性高于野生型,MDA含量低于野生型。本研究表明,MsFTL基因在提高植物对低温胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

菘蓝IiEMF基因的克隆与功能分析

该研究以菘蓝(Isatis indigotica Fort.)转录组数据为基础,克隆得到菘蓝EMF基因的cDNA全长,命名为IiEMF。(1)序列分析表明,IiEMF基因开放阅读框长度为1896 bp,编码631个氨基酸。进化树分析表明,菘蓝IiEMF蛋白与甘蓝(Brassica oleracea)EMF蛋白亲缘关系最为接近。(2)实时定量PCR结果显示,IiEMF在菘蓝不同器官中均有表达,且在叶中表达量最高,果实中表达量最低;IiEMF基因在菘蓝抽薹开花过程中叶内的表达量呈先升后降的趋势,并于初花期表达量达到最高后逐渐降低回落;在花/果期IiEMF基因表达量较花蕾中明显降低。(3)成功构建了超表达载体pCAMBIA1300-EMF,经农杆菌介导侵染拟南芥,PCR鉴定表明,有7株为超表达转IiEMF基因植株。(4)表型观察发现,在长日照和短日照条件下,与野生型相比2个转IiEMF基因拟南芥株系的开花时间都明显较早(提前6~10 d),且转IiEMF基因株系的莲座叶数比野生型多10片以上,叶片也比野生型大而肥厚。(5)qRT-PCR检测结果显示,在拟南芥营养生长过程中,过表达IiEMF显著抑制了拟南芥AtAP1、AtCO和AtLFY的表达,而促进了AtFLC的表达;当拟南芥开花时,转基因株系中的AtAP1和AtFLC表达量均高于野生型,AtCO和AtLFY的表达量显著低于野生型。研究表明,过量表达IiEMF基因能够促使拟南芥提前开花,且IiEMF可能是通过影响多种开花途径来共同调节促进拟南芥的早花。     

家蝇C-型凝集素的克隆与功能分析

【目的】从家蝇Musca domestica中克隆一种C-型凝集素(C-type lectin)基因,并分析其在家蝇免疫过程中的功能。【方法】根据家蝇转录组信息,克隆了一条C型凝集素基因,将其命名为Mdlectin-C1。构建Mdlectin-C1的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达并纯化r Mdlectin-C1蛋白,制备多克隆抗体。利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及Western blot技术对家蝇不同发育阶段和细菌感染前后Mdlectin-C1的表达水平进行检测。运用RNAi技术敲低家蝇1龄幼虫Mdlectin-C1基因表达,然后进行细菌刺激并观察幼虫存活率变化。【结果】Mdlectin-C1 c DNA包含一个546 bp完整开放阅读框,编码181个氨基酸残基,所推导多肽N端包含由21个氨基酸残基组成的信号肽,成熟肽中含有一个保守的碳水化合物识别结构域(carbohydrate-recognition domain,CRD)。qRT-PCR及Western blot结果显示,家蝇从1龄幼虫到蛹的发育过程中,Mdlectin-C1表达量逐步上升,蛹期达到最大值。在革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激后,家蝇2龄幼虫Mdlectin-C1均上调表达,并分别在36和3 h时达到最高值。利用RNAi技术成功敲低Mdlectin-C1表达。对Mdlectin-C1基因敲低的1龄幼虫进行细菌刺激,敲低实验组幼虫存活率显著低于正常对照组。【结论】Mdlectin-C1可能参与家蝇抗菌免疫应答,并在此过程中具有重要作用。     

益生菌对非酒精性脂肪性肝病小鼠肠道菌群及 STING信号通路的影响

探讨益生菌对高脂饮食（HFD）诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠肠道菌群及干扰素基因刺激因子（STING）信号通路的影响。

将SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（n = 20）、实验组（n = 20）及治疗组（n = 20）,对照组小鼠给予普通饲料,实验组和治疗组小鼠给予高脂饲料。喂养12周后,治疗组小鼠给予益生菌治疗,于治疗后第1、2和4周对3组小鼠进行各指标检测。采集小鼠粪便标本检测其肠道菌群数量;应用双能X线吸收法检测小鼠全身脂肪含量;使用酶联免疫吸附剂测定法检测肝功能指标和炎症因子水平;采用RT-qPCR及Western Blot检测STING及相关炎性细胞因子的表达;采用免疫组织化学技术检测巨噬细胞标志物F4/80的表达。

与实验组相比,治疗组小鼠肠道菌群得到改善,双歧杆菌和乳杆菌数量升高,肠杆菌、肠球菌及白假丝酵母数量降低（均P＜0.01）;治疗组小鼠脂肪含量降低（P＜0.01）,肝功能指标谷草转氨酶、丙氨酸氨基转移酶、三酰甘油及STING表达量显著降低（均P＜0.05）,F4/80⁺在肝脏组织中的比例明显降低（P＜0.01）。此外,与实验组相比,治疗组小鼠炎症因子肿瘤坏死因子-α、白介素1β、白介素6、干扰素β表达水平及磷酸化NF-κB p65水平显著降低,JNK-p46水平显著升高（均P＜0.05）。

益生菌可能通过抑制STING-TBK1-NF-κB通路改善肠道菌群,从而改善HFD诱导的NAFLD。

     

中华鳖白细胞介素21基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:从中华鳖脾脏、肝脏、肠道构建的SMARTer cDNA文库中克隆中华鳖白细胞介素21(IL-21)基因的cDNA。方法:采用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆中华鳖IL-21基因cDNA序列,并利用生物学软件进行生物信息学分析。结果:中华鳖IL-21 cDNA长874 bp,其编码产物包含135个氨基酸残基,二级结构主要包括α螺旋、延伸链、无规则卷曲和β转角,三级结构包括信号肽和IL-15结构域。系统进化分析表明其与鸟类首先聚类,其次为哺乳类。以人IL-21为模型,构建了中华鳖IL-21的3D结构模型。结论:从生物信息学分析可知我们所获序列为中华鳖IL-21 cDNA,为深入研究中华鳖IL-21及相关通路奠定了基础。     

猪CuZnSOD基因的克隆、表达及功能分析

为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用RACE(Rapid amplification of cDNA end)方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA进行克隆测序,分析其结构和功能,并用Real-timePCR检测CuZnSOD基因的表达.结果表明,CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号:GU944822),包含76 bp的5'UTR和120 bp的3'UTR序列.全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点为6.03.CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点.二级结构中α螺旋仅占1.31%.在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和褐鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%.CuZnSOD存在典型的金属结合配体结构域(GFHVHQFGDNT).基于蛋白序列所构建的分子进化树表明猪与牛的亲缘关系最近.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓,肌肉、背膘和胃中都能检测到,其在肾脏,小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.     

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A),分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp, 5′端非编码区68 bp, 3′端非编码区108 bp,开放阅读框399 bp,编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高,与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示,PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01),而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示, PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达,其中初级卵母细胞中表达信号最强,且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后,目的信号逐渐减弱,并且主要在核周区域表达。此外, PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上,研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。     

养殖中华鳖蜡样芽孢杆菌的分离、鉴定和致病性研究

2016年夏杭州某中华鳖(Pelodiscus sinensis)养殖场出现大量发病, 病鳖呈厌食、反应迟钝、四肢无力、池边独游、濒死前不停摇头等病症, 死亡率20%以上。用营养琼脂从典型症状濒死中华鳖分离到革兰阳性短杆状, 芽孢近中生或中生的分菌株; API 50 CHB对分离菌株T91-1鉴定结果显示与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)参考菌株ATCC 14579 97.4%相似; T91-116S rDNA和gyrB基因序列与ATCC 14579相似度为99%, 确认T91-1为蜡样芽孢杆菌。T91-1在羊血平板呈典型β溶血, 牛奶平板上出现明显透明圈, 表明存在溶血性和胞外蛋白酶类毒素。用T91-1肌肉注射感染健康中华鳖LD₅₀为4.91×105CFU/ind., 死亡鳖出现与自然发病鳖类似症状; 感染发病中华鳖血和肝印/涂片瑞氏-姬姆萨染色可见组织间隙有大量芽孢杆菌。自然发病鳖肾、肝、肺、心病理切片可见大量芽孢杆菌, 病鳖血管扩张充血, 嗜酸性粒细胞浸润。T91-1灌胃ICR乳鼠3d后可全部死亡, 死亡鼠呈皮下出血等症状; T91-1腹腔注射和灌胃ICR 4周龄小鼠12—24h可出现迟钝、厌食等症状, 1周内未出现死亡。上述结果表明蜡样芽孢杆菌对中华鳖有很强毒力, 对小鼠有较强肠毒性, 是引起本次杭州中华鳖暴发性疾病的病原。     

中华鳖GHRL基因SNPs的筛选及生长性状的关联分析

为探究GHRL基因多态性对中华鳖(Pelodiscus sinensis)生长性状的影响, 采用直接测序法在GHRL基因上检测到14个单核苷酸多态性位点C289T、G501T、T738C、G776T、A841G、T885C、T2960C、A2987T、G3390A、A3857C、G4718A、T4820C、A4850C、T4979C。随机选取同批繁殖的120只中华鳖用飞行时间质谱法进行SNPs位点的分型, 并分析与生长性状的相关性。检测结果显示, 所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。方差分析结果显示, C289T位点CT、CC基因型的5项生长数据均显著高于TT基因型(P<0.05)。S2位点AB基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项数据均显著高于AA基因型(P<0.05)。G3390A位点AG基因型的背甲长、背甲宽2项数据显著高于AA基因型(P<0.05)。G4718A位点AG基因型的背甲长、背甲宽、裙边宽3项数据显著高于AA基因型(P<0.05)。在GHRL基因上获得的SNP位点可能影响着中华鳖的生长性状或与之紧密连锁, 可为中华鳖分子辅助育种提供助力与参考。     

中华鲟促性腺激素释放激素受体基因cDNA序列的克隆及表达分析

为了研究中华鲟(Acipenser sinensis)促性腺激素释放激素受体(Gonadotropin-releasing hormone receptor, GnRH-R)基因在中华鲟中的组织表达特征, 为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据, 通过构建中华鲟(Acipenser sinensis)垂体的SMART cDNA质粒文库, 采用cDNA末端快速扩增(RACE), 克隆得到了中华鲟GnRH-R基因的cDNA全长序列。该序列全长1530 bp, 有478 bp的5′非翻译区, 579 bp的开放阅读框和473 bp的3′非翻译区, 共编码192个氨基酸, 其成熟多肽含有5个Ｎ连糖基化位点。通过和已知其他鱼类的GnRH-R基因进行氨基酸序列多重比对, 发现其与真鲷(Pagrus major)的同源性最高, 为76%, 与米氏叶吻银鲛(Callorhinchus milii)的同源性最低, 为39%。采用实时荧光定量PCR (Real time PCR)方法, 检测了GnRH-R的mRNA在中华鲟心、肝、脾、肾、肠道、精巢、肌肉及脑组织中的表达状况, 发现其在精巢中大量转录, 而在其他组织中则表达微弱。以上结果表明中华鲟GnRH-R基因在性腺发育特别是精子发生过程中可能起重要作用。     

中华鳖Foxl2基因克隆及外源性激素对其表达的影响

外源性激素在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定有重要作用, 为给中华鳖性别决定机制研究提供生物学信息, 首次克隆和分析了中华鳖Foxl2 cDNA部分序列。为研究其在遗传和生理水平的差异, 以10 mg/kg剂量17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E₂)分别对中华鳖雌雄个体注射, 检测0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表达水平。获得中华鳖Foxl2基因(GenBank登录号: KP734210)部分 cDNA长903 bp, 共编码300个氨基酸, 属于叉头框转录因子家族, 参与卵巢发育和功能维持; 多重序列比对显示, Foxl2具有典型的FH结构域, 与红耳龟的同源性最高, 达到99%; 系统进化树分析显示, 中华鳖Foxl2基因与爬行动物Foxl2基因聚为一个亚支, 且与西部锦龟Foxl2基因距离最近。荧光定量PCR结果显示, 与对照组相比, 注射E₂后24h, 卵巢Foxl2 mRNA表达水平被极显著上调(P<0.001), 7d和14d后, 精巢Foxl2 mRNA表达水平极显著上升(P<0.001); 注射MT后24h, 精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表达水平均极显著升高(P<0.001)。结果表明, E₂和MT促进Foxl2表达, E₂促进其表达的性别差异比MT明显。研究可为了解Foxl2的功能及明确外源性激素调控中华鳖Foxl2的分子机制提供基础资料。     

中华鳖vasa基因克隆及在卵母细胞中的表达分析

研究利用中华鳖为研究模型进行爬行类生殖细胞发育分化成熟等生物学研究,克隆了中华鳖vasa基因的cDNA序列,全长3865 bp,包括5'端非编码区90 bp,3'端非编码区1699 bp,开放阅读框长2076 bp,共编码691个氨基酸。中华鳖Vasa氨基酸序列包含DEAD-box家族蛋白8个保守保守功能域,在N末端有4个RGG重复序列和2个GG富集区,与小鼠Vasa蛋白的同源性较高（72%）。荧光定量PCR的结果表明,中华鳖vasa mRNA主要精巢和卵巢中表达,其他体组织中均难检测到表达。卵巢冰冻切片原位杂交结果显示:中华鳖vasa mRNA在生殖细胞中特异表达;在卵子发生过程中的不同发育期卵母细胞中呈现动态的变化。即vasa mRNA在初级卵母细胞及生长期卵母细胞中表达最强,且均匀分布在细胞质中,随着卵母细胞的逐渐增大,信号逐渐减弱,直至在成熟的卵母细胞中几乎检测不到表达信号,说明vasa可能在中华鳖早期卵母细胞发育中起重要作用。同时,vasa基因可作为中华鳖生殖细胞分子标记物,根据其mRNA的表达水平来鉴别不同发育时期的卵母细胞。研究结果为进一步开展中华鳖胚胎生殖细胞发育及配子生成,特别是研究中华鳖,乃至爬行类原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）的起源、迁移、分化等研究奠定了基础。     

中华鳖4个品系营养成分分析与比较

为了解墨鳖的营养价值, 对墨鳖、野生中华鳖、淮河鳖和日本鳖肌肉的一般营养成分、氨基酸含量、脂肪酸含量及裙边胶原蛋白进行测定和比较。结果显示: (1) 4个品系鳖肌肉水分含量分别为80.84%、79.48%、81.57%和79.25%, 墨鳖显著高于野生鳖和日本鳖(P<0.05); 粗蛋白含量分别是17.82%、17.60%、15.93%和16.40%, 墨鳖含量最高, 显著高于淮河鳖和日本鳖(P<0.05); 粗脂肪含量分别是0.42%、1.43%、0.65%和1.06%, 墨鳖显著低于其他鳖(P<0.05); 4个品系鳖灰分含量差异不显著(P>0.05)。(2) 4个品系鳖肌肉中总氨基酸和呈味氨基酸含量均以墨鳖最高。(3)4个品系鳖不饱和脂肪酸含量分别为65.19%、56.44%、59.32%和54.73%, 墨鳖显著高于其他鳖(P<0.05), 其中墨鳖单不饱和脂肪酸含量显著低于野生鳖(P<0.05), 多不饱和脂肪酸含量显著高于其他3个品系(P<0.05); 饱和脂肪酸含量分别为32.50%、41.85%、39.41%和39.98%, 墨鳖显著低于其他鳖(P<0.05)。(4)墨鳖肌肉中DHA和EPA含量与野生鳖差异不显著(P>0.05), 显著高于淮河鳖和日本鳖(P<0.05), 花生四烯酸(AA)含量显著高于其他3个品系鳖(P<0.05)。(5) 4个品系鳖裙边胶原蛋白含量均较高, 为160.6—170.4 mg/g。结果表明墨鳖是一种营养价值高、肉味鲜美的地方品系。     

大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的克隆及其功能研究

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒, 并对其功能进行了初步的研究。序列分析显示, 所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽; 其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点。Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外, 也可滞留在胞内。体外抗菌实验的结果表明, 过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖。此外, 过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性; 能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们。研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白。     

中华鳖肝金属硫蛋白的分离、纯化及鉴定

金属硫蛋白metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。MT几乎广泛分布于所有生物,包括哺乳动物、两栖动物、鱼、植物、真菌和蓝细菌,不同生物金属硫蛋白理化特性和其氨基酸序列及中心片段的比较研究,对研究MT的结构和生物功能及生物的分子进化提供重要依据。哺乳动物MT研究较多,爬行动物鳖MT的研究尚属空白,本文报道鳖肝的金属硫蛋白,中华鳖（Pelodiscus sinensis)分别经皮下注射ZnSO4,CuSO4和CdCl2溶液诱导后,取乙醇沉淀的肝脏无细胞提取液再经SephadexG-50、DEAE-SepharoseCL-6B及SephadexG-25凝胶过滤和离子交换柱层析分离,自鳖肝脏中分别获得Zn-MT、Cu-MT和Cd-MT,未经诱导的鳖肝脏中无MT,质谱和HPLC分析其分子量约为6300dalton。根据氨基酸组成分析。鳖肝脏MT含61个氨基酸残基,其中MT的典型氨基酸Cys含量占17%。Lys,Glu和Asp含量较高,而芳香族氨基酸和组氨酸含量极低,从紫外光谱特性分析,Zn-MT、Cu-MT、Cd-MT紫外吸收肩分别在220nm、270nm和250nm。表明确为鳖肝脏MT。从氨基酸残基数和分子量看,鳖肝脏MT与哺乳动物MT类似;而从氨基酸组成和结合金属离子的量看,又与低等生物蚯蚓酵母菌的MT类似。鳖MT的特性介于哺乳动物MT与低等生物MT之间,体现了鳖这种生物进化的特点。     

中国绿水螅抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、抗体制备及表达分析

为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)基因的起源及功能, 研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp, 包括5′非编码区107 bp, 3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame, ORF) 1104 bp, 共编码367个氨基酸, 预测蛋白质分子量为40.79 kD。BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界; 通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的APX序列各自形成单系群。把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中, 重组质粒转化E. coli BL21 (DE3)菌株, IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX, 再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay, WB)。在不同光照时长梯度(光强度2000 lx, 每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d, 实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调。在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内, 此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧。