基于高通量转录组测序的草鱼雌雄性腺差异表达基因分析

草鱼雌性个体生长优势明显高于雄性,挖掘精巢和卵巢差异表达的功能基因对草鱼生殖调控具有重要的价值及应用前景。采用Illumina HiSep 2500转录组测序技术分别对12月龄的3尾雌性草鱼和3尾雄性草鱼的性腺组织的mRNA进行测序分析,精巢和卵巢共得到8 363个差异表达基因。与卵巢相比,精巢上调基因6 446个(77%),下调基因1 917个(23%),差异明显。将上述差异基因在Nr、GO和KEGG数据库进行比对,获得48种Go功能注释分类和313条KEGG代谢通路。分析发现,Go功能分类中"绑定"功能富集差异基因的数量最多,占总数的15.8%;KEGG代谢通路中"信号转导"通路富集差异基因的数量最多,占总数的10.2%。结合转录本数据,挑选与草鱼性腺发育相关的关键差异基因Dmrt1、amh、foxl2、cyp19a1a进行分析,研究显示,与卵巢相比,Dmrt1和amh基因在草鱼精巢中极显著高表达(p0.01);与精巢相比,cyp19a1a和foxl2基因在草鱼卵巢中显著高表达(p0.05),与转录组数据分析结论一致,说明Dmrt1和amh基因与早期草鱼精巢发育调控相关,cyp19a1a和foxl2基因与早期草鱼卵巢发育调控相关。本实验为进一步了解草鱼性别基因的调控机理提供数据依据。     

miR-133b可能通过调控foxO1的表达影响小鼠B细胞发育

microRNAs(miRNAs)是一类具有转录后调控作用的非编码RNA,在发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用.为全面了解小鼠B细胞中miRNAs的表达模式,利用流式细胞仪(FACS)分选处于不同发育时期的B细胞,采用TaqMan誖低密度芯片对其进行检测,筛选到pre-B阶段9个miRNAs表达量显著上调.将筛选出的miRNAs进行靶基因预测,并对预测靶基因进行功能聚类和通路分析,发现约4%的基因参与免疫系统过程,包括Bcl2、Kit等.选取foxO1与miR-19b、miR-142-3p、miR-106b、miR-182及miR-133b进行初步功能验证,双荧光素酶报告系统及Westernblot检测结果均显示,miR-133b可直接作用于foxO1 3′UTR从而降低foxO1的表达.结合人类和小鼠B细胞中foxO1的表达情况分析,其表达模式同miR-133b表达模式呈负相关,说明miR-133b可能参与了B细胞发育过程中foxO1的表达调控过程.     

翘嘴鲌Sox9基因的克隆及CpG岛甲基化与基因表达的关系

为了揭示翘嘴鲌(Culter alburnus)性别决定与分化的作用机制, 进而更好地发展性别控制育种技术, 研究重点分析了Sox9基因在翘嘴鲌性腺分化过程中的作用。通过RT-PCR和RACE方法获得了翘嘴鲌2个旁系同源基因Sox9a和Sox9b的cDNA序列: Sox9a全长1642 bp, 编码458个氨基酸; Sox9b全长1673 bp, 编码456个氨基酸。序列分析表明两者相似度达到73.95%, 编码HMG盒区域极其保守。蛋白质次级结构预测显示Sox9a和Sox9b除了保守的HMG盒结构域外, 还存在2个核定位信号; 两者的三维结构都存在多个螺旋结构。系统进化树分析发现翘嘴鲌Sox9a与罗非鱼关系最近, 但Sox9b形成单独的一支。利用实时荧光定量PCR技术分析了翘嘴鲌Sox9a和Sox9b基因在各成体组织中的表达水平, 结果显示Sox9a在脑和精巢中表达量最高, 其次是肌肉、鳍条、眼睛和卵巢, 在肾脏、脾脏、肝脏中相对较低; Sox9b只在脑、鳍条、眼睛和精巢中检测到一定水平的表达。通过重亚硫酸氢盐DNA测序方法分析了翘嘴鲌性腺组织Sox9a启动子CpG岛甲基化修饰模式, 结果显示在精巢中CG位点几乎不发生甲基化, 然而卵巢中的甲基化程度非常高。这些结果表明启动子CpG甲基化可以调控Sox9a的性别异形表达, 表观遗传修饰在翘嘴鲌性腺发育过程中可能具有重要的生物学功能。     

家蚕FoxG转录因子的鉴定及其在精巢发育中的功能初探

[目的]Fox家族蛋白是调控动物发育的关键转录因子.本文分析了鳞翅目昆虫家蚕Bombyxmori的BmFoxG亚家族蛋白在精巢发育中的作用,为基于生殖系统的家蚕性状优化或害虫不育技术的开发提供理论依据.[方法]利用PCR克隆家蚕BmFoxG-1 和 BmFoxG-2基因;通过生物信息学工具对BmFoxG蛋白的结构及理化性质进行分析;采用qPCR技术检测BmFoxG基因在家蚕不同发育阶段的精巢中的表达变化;在家蚕Bm12细胞株中过表达BmFoxG-1,并通过qRT-PCR分析BmFoxG-1调控的靶基因.[结果]本文克隆获得了 BmFoxG-1(933 bp)和 BmFoxG-2(702 bp)两个基因.BmFoxG-1 和 BmFoxG-2蛋白均包含保守的Forkhead结构域,但BmFoxG-1蛋白在C端多出约60个氨基酸.BmFoxG-2基因在家蚕不同发育时期的精巢中的表达量均较低;BmFoxG-1 的表达均显着高于BmFoxG-2,且随着发育时期而变化,暗示BmFoxG-1参与精巢的发育.生殖细胞发育基因BmVasa、BmCyclinA等多个细胞周期基因以及精子鞭毛发育相关基因BMSK0009828在不同发育阶段的精巢中的表达趋势与BmFoxG-1类似,且BmFoxG-1在家蚕细胞中的过表达可以显著上调BmVasa、BmCyclinA和BMSK0009828等精巢发育相关基因的表达.[结论]我们推测BmFoxG-1蛋白可能通过调节精巢细胞周期或生殖细胞的功能来调节家蚕精巢的发育.     

鸡miR-19a、miR-19b通过靶向抑制LIN9促进前脂肪细胞增殖

miR-17-92基因簇编码包括miR-19a、miR-19b在内的至少6个miRNA,在鸡细胞的增殖、分化、凋亡及发育等多种生物学过程中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚。生物信息学分析显示,细胞周期调控子LIN9是 miR-17-92 基因簇成员miR-19a和miR-19b的潜在靶点。为验证这一预测,构建含野生型LIN9 3′-UTR荧光素酶报告基因载体（psi-CHECK2-LIN9-3′-UTR-WT）及突变型报告基因载体（psi-CHECK2-LIN9-3′-UTR-MUT）,开展靶标LIN9的鉴定。复合转染结合报告基因酶活性测定结果表明,过表达miR-19a和miR-19b能显著抑制含野生型LIN9 3′-UTR的报告基因表达,而过表达miR-19a和miR-19b抑制剂显著提高野生型LIN9 3′-UTR报告基因的表达。实时定量PCR（RT-qPCR）证明,miR-19a和miR-19b 抑制剂对内源性LIN9 mRNA的表达没有影响,提示miR-19a和miR-19b可能不是通过降解mRNA调控LIN9表达。转染结合CCK-8细胞增殖分析显示,在鸡前脂肪细胞过表达LIN9 明显抑制细胞增殖。与此相一致的是,细胞增殖标志分子CyclinD1、c-Myc、PCNA、Ki67 的mRNA表达量明显降低。本研究证实,LIN9是miR-17-92 基因簇成员miR-19a和miR-19b的靶标,同时证实,LIN9抑制鸡前脂肪细胞的增殖。是否miR-17-92基因簇编码的其它mi-RNA成员也以LIN9为靶标尚不得而知,我室正在研究中。     

黄河鲤性别决定时间和相关基因表达研究

鱼类性别决定和分化机制极为复杂,通过性腺组织切片鉴定得出黄河鲤从未分化性腺发育为Ⅱ期精巢、卵巢的时间为受精后第40天到第80天。选取一些可能参与黄河鲤性别决定分化相关的基因（amh、ar、cyp19a、cyp19b、dax1、dmrt1、er、foxl2、nobox、sox9a、sox9b、zp2）进行实时荧光定量PCR分析各个基因在受精后40d、45d、50d、55d、65d和80d的表达情况。结果显示性别决定相关基因在50d都有高表达,推测45-50 d为性别决定的关键时间。ar、amh、dax1、dmrt1、sox9a、sox9b六个基因在80d雄性表达量升高,且雄性明显高于雌性,推测这些基因参与精巢分化发育过程。cyp19a、cyp19b、foxl2、nobox、zp2五个基因在80d雌性表达升高,且高于雄性,推测其可能参与卵巢分化发育。     

鸡miR-148a的组织表达及其发育调控功能预测分析

为了解鸡miR-148a组织表达谱和潜在发育调控功能,采用茎-环定量RT-PCR检测了固始鸡5个发育阶段、15种组织中miR-148a的表达,利用Pictar和TargetScan算法预测了miR-148a的靶基因,并对预测靶基因分别进行了Gene Ontology分析和通路分析. 结果显示,miR-148a的表达具有明显的时序特征,胚胎期各组织中的表达水平明显低于出壳后;miR-148a在出壳后的大脑、小脑、延脑、腺胃、小肠、肝、胰和胸肌等器官组织中的表达水平随着发育进程被显著上调;miR-148a预测靶基因在胚胎器官形态发生、血细胞生成、消化道形态发生、心血管发育、感觉器官发育、肠发育、骨骼系统发育、后脑发育、呼吸系统发育、免疫系统发育、淋巴器官等发育过程显著富集. 总之,鸡miR-148a为广泛性表达miRNA,可能参与鸡诸多器官组织发育过程的调控.     

MiR-26b是前列腺癌中的抑癌微RNA（英文）

微RNAs(又称miRNAs或miRs)是一类长度为19~24个核苷酸的单链非编码RNA分子.miRNA通过与其靶向的mRNA分子序列特异性互补配对,调节mRNA表达水平,抑制转录后的蛋白质翻译.miRNA在肿瘤中既可作为致癌因子也可作为抑癌因子.本研究前期已报道miR-26b在前列腺癌细胞系中低表达,并且抑制细胞自噬.本研究进一步全面揭示miR-26b对前列腺肿瘤细胞的作用.我们发现过表达miR-26b能够在体外抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭,并抑制裸鼠体内原位异种前列腺肿瘤的生长.为了探究miR-26b对前列腺癌细胞增殖和侵袭的潜在调控机制,我们进行了表达谱芯片鉴定miR-26b调控基因.表达谱芯片分析表明,在前列腺癌细胞系PC-3中过表达miR-26b后,显著上调的基因57个,显著下调的基因55个(变化倍数均大于2,且P值小于0.05).差异基因的功能多与细胞增殖、凋亡调控、蛋白质磷酸化和泛素化修饰调控过程相关,并且富集在多种信号通路中,例如TNF和TGF-β信号通路.在这些筛选出的基因中,CEACAM6表达水平下调2.17倍;序列分析及实验验证表明,CEACAM6的3′UTR区存在miR-26b的互补序列,是miR-26b的直接靶标.本研究证明了miR-26b能够靶向结合抑制CEACAM6的表达,从而抑制前列腺癌细胞在体外和体内的细胞增殖和侵袭活性,miR-26b是前列腺癌中的抑癌microRNA.     

微小分子miR-125b新靶基因的鉴定及其功能初步研究

目的:利用生物信息学方法预测miR-125b的新靶基因,在肝癌细胞系中进行验证和结合位点的鉴定,为阐明miR-125b在肝癌发生发展中的作用和机制提供新线索。方法:Western印迹分析在肝癌细胞中过表达miR-125b后上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白的表达情况;对肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织的miR-125b表达差异进行实时定量PCR检测,同时对SNAIL1的表达情况进行免疫组化检测;用生物信息学方法预测miR-125b的新靶基因;利用双萤光素酶报告系统验证miR-125b在预测的新靶基因mRNA的3'非翻译区是否有直接结合位点;构建新靶基因的真核过表达载体,检测新靶基因过表达后对miR-125b表达水平的影响。结果:在肝癌细胞中过表达miR-125b可抑制细胞EMT过程,下调α平滑肌肌动蛋白、神经钙黏素的表达;miR-125b在肝癌患者肿瘤组织中的表达远低于癌旁组织,而SNAIL1作为调控EMT的主要转录因子之一,其在肿瘤组织中的入核比例明显高于癌旁组织;用TargetScan预测到snail1是miR-125b的潜在靶点之一,但双萤光素酶实验表明snail1并非miR-125b的直接靶基因。此外,我们意外发现在肝癌细胞中过表达SNAIL1可上调miR-125b的表达。结论:miR-125b可抑制肝癌EMT过程,但并非直接通过靶向snail1发挥作用,两者在肝癌细胞中存在着复杂的间接调控关系。     

miR-202-5p在牙鲆性腺中的表达分析及其与cbx2靶向关系验证

为研究miR-202-5p在鱼类中作用的靶基因及功能,采用荧光定量PCR和原位杂交技术构建了miR-202-5p在牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织和雌雄性腺中的表达谱。定量结果发现, miR-202-5p在牙鲆性腺中具有特异性的高表达,且在精巢中的表达水平高于卵巢。原位杂交结果显示, miR-202-5p主要在精巢的精原细胞和精母细胞中表达,而仅在卵巢的Ⅳ和Ⅴ期卵母细胞中有较强烈表达。研究发现色素框同源蛋白2(Chromobox homolog 2, CBX2)在性腺发育中具有重要调节作用,为进一步研究miR-202-5p在牙鲆性腺发育中的功能,采用生物信息学方法预测和双荧光素酶报告基因技术鉴定了二者的靶向关系,结果证实, cbx2为miR-202-5p直接调节的靶基因,为深入阐述miR-202-5p在牙鲆性腺发育中的作用机制提供了基础。     

Alternative splicing and differential expression of P450c17 (CYP17) in gonads during sex transformation in the rice field eel

Several mechanisms were used in determination of the development of the male or female of vertebrates. The genes for determination of sequential hermaphrodite sex are unknown. Here, we reported cloning, alternative splicing, and expression patterns of the CYP17 gene of the rice field eel, a teleost fish with a characteristic of nature sex reversal. The CYP17 gene of the rice field eel was clustered into the CYP17 gene group of all the other vertebrates, especially into the fish subgroup. Four isoforms of the CYP17 were generated in gonads by alternative splicing and polyadenylation. Alternative splicing events of all these isoforms occurred in 3(') regions, which encoded three different sizes (517, 512, and 159aa) of proteins. RT-PCR results indicate specific expression in gonads of these isoforms. Northern blot analysis shows that expression patterns of the CYP17 (dominantly expressed in testis, less in ovary, and the least in ovotestis) are consistent with the sex reversal process of the rice field eel. In situ hybridization further shows its specific expression in germinal lamellae, the gonadal epithelium of the gonads. These findings indicate that CYP17 is differentially regulated in a sex- and developmentally specific manner, suggesting that the CYP17 potentially has important roles in gonad differentiation during sex reversal of the rice field eel.     

黄鳝Nup93基因的分子克隆及其在性腺和肾的显著表达

核孔蛋白（Nucleoporins,Nups）是核孔复合体（Nuclear pore complexes,NPC）的重要组成成分,核孔复合体可以控制细胞内信号分子在核质问的双向转运,从而控制基因表达、细胞增殖和分化。在构建的黄鳝精巢SMART cDNA文库中,采用差异筛选的方法得到黄鳝核孔蛋白家族中Nup93基因的3’端片段,根据此段序列设计引物,使用兼并PCR和5＇RACE方法克隆得到此基因的全长cDNA。序列比对显示该基因与酵母Nic96、斑马鱼Nup93和人类Nup93的同源性分别为36．5％、94．6％和90．5％。进化树分析显示,黄鳝Nup93与其他鱼类的Nup93归为一支。采用荧光定量PCR方法对不同性别黄鳝的性腺和其他组织内该基因的表达作定量分析发现,Nup93在性腺和肾中的表达量远高于其他组织,而且表达量存在一定的性别差异。这一结果提示Nup93可能与性腺发育相关。     

Identification and predominant expression of annexin A2 in epithelial-type cells of the rice field eel

Annexin is the largest family of genes encoding eukaryotic calcium-binding proteins that do not contain the EF hand motif. Annexin A2 has a common annexin core domain, consisting of four so-called annexin repeats, and each of these repeats has about 70 amino acids in length. Here we report identification of annexin A2 from rice field eel by degenerate PCR and RACE techniques. Three-dimensional structure prediction shows that it has similar annexin repeat architecture. Phylogenetic analysis shows that this gene fits with the annexin A2 clade of vertebrates. Subcellular co-localization and co-immunoprecipitation indicated annexin A2 interacted with its ligand S100A10, confirming characteristics of the rice field eel annexin A2. RT-PCR and Western blot results indicate annexin A2 expressed ubiquitously in adult tissues. Immunofluorescence analysis shows obvious immunoreactivity in the nuclear membrane of developing oocytes and base membrane of mature oocytes in ovary and ovotestis. After the gonad differentiates into testis, annexin A2 protein expressed in the site of seminal vesicles epithelium in testis. The results provided a clue to the potential role of annexin A2 in the gonadal differentiation from ovary, via ovotestis to testis of the rice field eel.     

养殖施氏鲟的性腺转录组特征分析

鲟是目前世界上最古老的软骨硬鳞鱼类之一, 雌雄个体之间无明显的第二性征。为了解人工养殖下鲟性腺发育的分子特征, 研究以人工养殖2龄施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)为研究对象, 对其精巢与卵巢进行转录组测序分析。结果发现, 雌雄性腺中共有19690个差异表达基因转录本, 其中与性别分化相关基因包括转录因子Dmrt1、Sox9、Foxl2等和生长转化因子Amh、Bmp15、Gdf9等。另外, 通过差异表达基因KEGG代谢通路富集分析发现了4条与卵巢发育相关的通路, 分别为黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、卵巢类固醇合成、促性腺激素释放激素信号通路。其中, 卵巢类固醇合成通路中18个差异表达基因的表达模式暗示了2龄施氏鲟限制卵巢雌激素的合成, 但精巢中雄激素的合成未受影响。研究结果为研究鲟性腺分化和发育机制以及今后在mRNA表达水平上鉴定鲟性别提供了基础。