不同剂量rhBMP-2/CPC 体内骨诱导活性的比较研究*

目的:对比不同剂量rhBMP-2与多孔CPC复合后的诱导成骨效应,探讨与多孔CPC复合后的rhBMP-2的量效关系.方法:将0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml 4种不同剂量的rhBMP-2与多孔CPC材料复合后,植入36只小鼠双侧股部肌肉内,分别于术后1周、2周及4周取材,通过大体观察、组织学分析、形态计量学分析、荧光双标测定,观察4组诱导成骨情况.结果:植入1周,rhBMP-2与多孔CPC材料复合表现出了较明显的剂量依赖性,含有较多rhBMP-2的材料内诱导形成的骨组织也较多,但骨组织的增加并未随着rhBMP-2剂量的增加而连续递增,2 mg组和3 mg组新生骨组织含量无明显差异(P＞0.05).植入4周,新生骨组织向材料内部生长,但此时的新生骨组织面积较2周增加不显著(P＞0.05).0.5 mg组新生骨组织含量仍处于最低水平,而其它三组之间却无明显差异(P＞0.05).结论:在0.5 mg/ml-2.0 mg/ml剂量范围,与多孔CPC复合的rhBMP-2诱导成骨量与其剂量成正比,最佳剂量为2 mg/ml.     

补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响

目的:探讨补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响及其可能机制。方法:选取3月龄无特定病原体级健康雌性SD大鼠25只,通过切除卵巢建立绝经大鼠模型。6周后,通过全骨髓贴壁法分离BMSCs并进行原代和传代培养,传至3代后进行成骨和成脂诱导,并按补骨脂素浓度梯度0、5、10、15、20μmol/L进行处理。细胞增殖2周后,通过碱性磷酸酶(ALP)染色实验和油红O染色观察BMSCs成骨和成脂的分化,应用蛋白免疫印迹法测定核心结合蛋白因子RUNX2、骨钙素(OCN)、增强子结合蛋白β(C/EBP-β)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达。结果:成骨诱导BMSCs在补骨脂素的作用下ALP染色呈阳性反应,且补骨脂素的浓度为15μmol/L时阳性反应最强。RUNX2、OCN蛋白的表达随着补骨脂素浓度的升高而升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与空白组比较,成脂诱导BMSCs在补骨脂素的作用下油红O染色阳性反应程度出现下降,补骨脂素浓度为20μmol/L时,油红O染色阳性率最低。C/EBP-β、PPAR-γ蛋白的表达均随着补骨脂素浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:补骨脂素体外可增强BMSCs成骨分化作及抑制BMSCs成脂分化,可能与其调节RUNX2、OCN、C/EBP-β和PPAR-γ蛋白的表达有关。     

海绵状的小肠粘膜下层促进成骨样细胞增殖分化

目的:观察人脂肪干细胞(hADSCs)诱导分化的成骨样细胞在海绵状的猪小肠粘膜下层(SIS)表面的生长情况,探讨三维立体海绵状的SIS能否促进成骨样细胞的增殖和分化.方法:采用物理和化学结合的方法将猪近段空肠制备成脱细胞的SIS,再将薄膜状的SIS经液氮低温研磨制成微粒,交联后采用冷冻干燥技术重塑形为海绵状的SIS;原代培养hADSCs,流式术检测表面抗原,诱导其成骨、成软骨、成脂分化并染色鉴定;将诱导的成骨样细胞与海绵状SIS复合培养,扫描电镜观察细胞形态;应用SIS材料浸提液培养成骨样细胞,MTT法检测细胞增殖情况,ALP活度检测成骨分化情况.结果:脱细胞的SIS未见有核物质,海绵状的SIS呈三维立体状,具有大量均匀一致的孔隙;原代培养的hADSCs表达干细胞相关抗原,并可分化为成骨样细胞,茜素红将钙结节染成紫红色.成骨样细胞与海绵状SIS复合培养后,细胞生长旺盛增殖能力强,ALP表达量明显增加.结论:海绵状的SIS具有均匀的三维孔隙,细胞相容性好,能明显促进hADSCs来源的成骨样细胞的增殖及成骨分化,可成为骨组织工程新型的三维立体天然生物衍生材料.     

尿酸影响人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中BMP-2 表达

目的:探讨在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)成骨分化过程中,不同浓度尿酸(UA)对骨形态形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响。方法:以全骨髓贴壁培养法分离h BMSCs,将生长状态良好的第3代h BMSCs分为5组,分别为空白对照组(加入完全培养基)和成骨诱导组(加入成骨诱导液及含0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L尿酸的完全培养基)。连续干预诱导14d后,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,通过观察茜素红染色情况及检测碱性磷酸酶(ALP)活性进行成骨情况的检测。RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2 mR NA的表达情况。结果:第3代h BMSCs大多为形态单一的长梭形,呈旋涡状生长;干预诱导后的细胞逐渐变成不规则的立方形,局部形成团块状结节,以含尿酸浓度为0.8 mmol/L的成骨诱导培养基最为显著。连续干预14d后,空白对照组茜素红染色为阴性,而各成骨诱导组细胞茜素红染色结果为阳性,提示干预诱导后的细胞为成骨细胞。碱性磷酸酶活性随尿酸浓度的增加和干预时间的延长而增强(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,空白对照组无BMP-2 mR NA的表达。成骨诱导组随培养基中尿酸浓度的增加,BMP-2 mR NA表达逐渐增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:尿酸上调h BMSCs向成骨细胞分化过程中BMP-2 mR NA的表达。     

器官型脑片培养液对BMSCs向神经元样细胞分化的诱导作用

目的在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymalstem cells,BMSCs),观察BMSCs的形态特征和分类,并诱导其向神经细胞分化,探讨BMSCs向神经细胞诱导分化的可能性和条件。方法取大鼠骨髓,用直接贴壁法培养、传代,取第3代细胞(P3)进行CD34,CD71免疫细胞化学染色鉴定。BMSCs(P3)诱导前24h加1ug.L-1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以促分裂。再以脑片培养液作为条件培养液进行诱导,随后进行Nissl、神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色。结果BMSCs中含有较小的长梭形细胞,较大的扁平细胞及中等大小的圆形细胞,经鉴定CD34阴性,CD71弱阳性;诱导后BMSCs中长梭形细胞形态呈神经元样外形,Nissl的表达上调,NSE阳性,GFAP阴性。较大的扁平细胞形态变化不明显。结论BMSCs中含有多种细胞,细胞放置于脑片培养液微环境中可以分化为神经细胞,具有治疗神经系统疾病的潜能。     

Periostin表达上调对去势大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的作用

目的:探究Periostin(骨膜蛋白)表达上调对雌性去势大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化、细胞增殖与凋亡特性的作用。方法:通过去势手术建立雌性大鼠骨质疏松模型,待建模成功后分离培养并鉴定BMSCs,利用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠Periostin基因的重组慢病毒转染P3代BMSCs,成骨诱导后鉴定其成骨分化能力改变,流式细胞仪检测其细胞周期以及细胞凋亡率的变化。结果:成功建立骨质疏松模型;荧光显微镜下观察到绿色荧光提示慢病毒载体实现转染并表达目的蛋白;慢病毒转染组BMSCs成骨诱导后ALP及茜素红染色较去势组BMSCs染色加深;慢病毒转染组BMSCs的S期细胞比例为(17.07±0.56)%,显著高于去势组BMSCs的S期细胞比例(8.42±0.02)%,差异具有统计学意义(P0.05);慢病毒转染组BMSCs的细胞凋亡率为(7.3±0.1)%,显著低于去势组BMSCs的凋亡率(12.05±0.55)%,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论:Periostin表达上调可提高去势骨髓间充质干细胞的成骨分化及细胞增殖能力,并对其凋亡有抑制作用。     

两种不同诱导液对人牙周膜干细胞膜片性能的影响

目的:对比分析发育期根端复合体(Dental Apical Complex,DAC)诱导液和成骨诱导液对人牙周膜干细胞(Periodontal ligam-ent Stem Cells,PDLSCs)膜片形成和分化能力的影响。方法:收集临床十名12-16岁的青少年因正畸需要拔除的健康、无龋的新鲜牙(前磨牙),刮取根面残留牙周膜进行牙周膜干细胞的分离培养,制备成牙周膜干细胞膜片,分别采用DAC诱导液和成骨诱导液对膜片进行诱导,对比分析两种诱导液对牙周膜干细胞膜片的影响。结果:DAC诱导液处理过的PDLSCs细胞膜片,细胞形态接近牙源性间充质细胞,DAC诱导液提供了良好的成牙骨质-牙周样结构诱导环境,可促进PDLSCs膜片向功能性成牙骨质细胞谱系分化,而成骨诱导液提供了良好的成骨诱导环境,可促进PDLSCs膜片向功能性成骨细胞谱系分化。结论:DAC诱导液较之于成骨诱导液更利于PDLSCs细胞膜片的成牙周样分化,利于牙周缺损修复和局部再生。     

bFGF和BMP-2联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形成蛋白-2(BMP-2)联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与骨向分化的影响.方法:体外培养兔骨髓间充质干细胞,在第2代细胞培养液中加入不同浓度的bFGF和BMP-2,依据加入bFGF和BMP-2浓度的不同分为5个实验组(组1:80 ng/ml bFGF;组2:80 ng/ml BMP-2;组3:30 ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2;组4:50ng/ml bFGF 50ng/ml BMP-2;组5:80ng/ml bFGF 80ng/ml BMP-2)和对照组(不加任何生长因子),采用绘制生长曲线,四唑盐比色法(MTT),碱性磷酸酶(ALP)活性检测法和碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色法比较各组间差异,观察不同浓度的bFGF和BMP-2联合应用对兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响.结果:与对照组相比,单独应用80 ng/ml bFGF可显著促进BMSCs的增殖,但对BMSCs的骨向分化显著抑制;单独应用80 ng/ml BMP-2对BMSCs的增殖和骨向分化均有促进作用;30ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2、50 ng/ml bFGF 50 ng/ml BMP-2和80 ng/ml bFGF 80 ng/ml BMP-2可显著地促进BMSCs增殖和促进BMSCs的骨向分化,且呈正性剂量-效应关系,联合应用两种生长因子较二者单独应用促细胞增殖及骨向分化的效果更为显著.结论:一定浓度范围内,bFGF和BMP-2的联合应用促进BMSCs增殖的同时也促进其骨向分化,两者对BMSCs有明显的协同增强的生物学效应.     

真皮成纤维细胞成骨分化的实验研究

目的比较不同诱导剂对真皮成纤维细胞成骨分化的不同影响,探讨成纤维细胞成骨分化机制。方法取新生大鼠皮肤进行组织块培养,真皮成纤维细胞分离培养及鉴定,并分别由地塞米松、1,25(OH)2D3以及地塞米松和1,25(OH)2D3进行成骨分化诱导。分别于诱导后14d行ALP含量测定,21d行茜素红染色,并进行TAZ表达检测。结果真皮成纤维细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白;成纤维细胞诱导14d后,1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组ALP含量与对照组有显著差异;成骨诱导21d,地塞米松诱导组仅见少量散在红色钙结节形成,1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量增高,地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量明显增高,直径变大;1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组,经TAZ免疫荧光染色,可见部分细胞核表达TAZ。结论地塞米松可促进1,25(OH)2D3诱导真皮成纤维细胞成骨分化。     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和诱导条件下的成骨能力。方法通过密度梯度离心和贴壁培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、p甘油磷酸纳和维生素c的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化并检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,14d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞。