大豆基因工程根瘤菌田间结瘤和共生固氮效应

利用三亲本接合转移方法,将快生型大豆根病菌B_(52)的基因文库克隆转移到受体菌慢生型大豆根瘤菌2210中,获得4株大豆基因工程根瘤菌(32.43、B—2—6、B—3—8)。田间接种试验表明:在大豆分枝期(V2),43和32结瘤效分别比不接种对照增加117.9％和100.4％;在初花期(R_1),32和B—2—6结瘤数分别比对照增加122.5％和91.6％,根瘤固氮酶活性增加233.3％和195.6％;在结荚始期(R3),B—2—6和32结瘤数比对照增加78.5％和70.1％,根瘤固氟酶活性43和B—2—6分别比对照增加53.4％和49.3％。产量统计表明:32、B—2—6和43比对照分别增产16.8％、14.3％和12.2％,亩增收大豆分别为28.2、24.1和20.6公斤。以上三个菌株均比受体菌株2210增产率高。     

优良大豆根瘤菌田间增产效果初报

我所将中国农科院土肥所生物固氮组从佳木斯地区土壤中根瘤分离的快。慢型大豆根瘤菌,从中筛选出的优良菌株２１７８、２１８７及其丸衣、２２３５、混合菌等接种于当地主载大豆品种合丰２５号、３１号、３３号上,表现出较高的田间共生效应,能促进生育、增加根瘤数和固氮量,产量两年比对照增产幅度在９．２—２５．４％,比６１Ａ７６增产４．６—１９．５％。     

鲁黄1号大豆与根瘤菌的共生匹配性

大豆可与中华根瘤菌属及慢生根瘤菌属的多种根瘤菌共生固氮.研究大豆品种与不同种根瘤菌之间的共生匹配性,对获得高效根瘤菌用于接种,提高大豆的产量及品质有重要的理论和实践意义.本研究使用黄淮海地区的优质高蛋白大豆品种鲁黄1号从当地土壤内捕捉并分离纯化到27株根瘤菌.经持家基因recA的序列分析,发现其中18株属于中华根瘤菌属,9株属于慢生根瘤菌属.选用两个属的代表菌株各一株(Sinorhizobium fredii S6和Bradyrhizobium sp. S10),分别在蛭石、土壤盆栽及大田试验条件下,研究这两株菌单独及混合接种对鲁黄1号大豆的生长、结瘤、固氮活力、产量、种子蛋白含量及含油量的影响.结果表明： 与S10菌株相比,S6菌株对大豆的促生能力更强,对提高产量和品质的效果更好,从而确定S6为与鲁黄1号大豆相匹配的高效根瘤菌,可作为黄淮海地区推广种植鲁黄1号大豆时接种高效根瘤菌的菌种资源.
     

新疆土著大豆根瘤菌的表型多样性

选用分离自新疆昌吉市郊土壤的大豆根瘤菌61株和参比菌5株,对它们进行唯一碳氮源、抗生素抗性和抗逆性等表型性状分析,结果表明所有菌株在70.1％相似水平上分为快生大豆根瘤菌和慢生大豆根瘤菌2群,其中快生大豆根瘤菌在81.4％相似水平上又分为2个亚群,40株供试的新疆快生大豆根瘤菌与新疆中华根瘤菌聚为一群;7株供试菌聚为一小群,抗逆性强。所有供试快生菌株都与费氏中华根瘤菌相似性低,所以新疆快生大豆根瘤菌可能是与费氏中华根瘤菌相独立的一个种。     

快生型大豆根瘤菌在山东嘉祥获得了良好的田间应用效果

中国农业菌种保藏中心从我国九省、市、自治区的11个不同生态环境中收集到57株快生型大豆根瘤菌,通过水培、沙培试验,对其生物学特性进行了鉴定,通过固氮酶活性、植株干重、茎叶含氮量的测定,明确了快生型大豆根瘤菌总的共生特点.快生型大豆根瘤菌大多能与相适应的中国栽培大豆有效共生,固氮酶活性一般在200～300nMC_2H_4/克鲜瘤.分单株干重和茎叶含氮量比不接种对照提高1倍左右,比慢     

导入三叶草素基因（tfx）的快生型大豆根瘤菌竞争结瘤能力的研究

以导入三叶草素基因（tfx）的快生型大豆根瘤菌H12－2（pXK）和H12－2（p3K）为供试菌株,以出发菌H12－2和8株对三叶草素敏感的快生型大豆根瘤菌混合群体为对照菌,分别在盆栽条件下进行竞争结瘤试验。结果表明,产素菌H12－2（pXK）在两个大豆品种上的占瘤率均高于不产素的重组菌H12－2（p3K）。以H12－2为对照菌时,H12－2（pXK）占瘤率比H12－2（p3K）高出22％～26％;以8株快生型大豆根瘤菌混合群体为对照菌时,可提高30％～34％。     

2,4-D诱发小麦根瘤及引导根瘤菌进入小麦根瘤细胞的研究

本文通过水培和砂培的冬小麦(丰抗8号),研究用2,4-D处理并接种慢生型大豆根瘤菌61A76(Bradyrhizobium japonicum 61A76)和快生型沙打旺根瘤菌16(Rhitobium sp. astrugllus16),诱发小麦形成含菌根瘤的可能性。结果表明2,4-D可诱发小麦根系产生瘤状结构,此瘤状结构起始于根中柱鞘,2,4-D刺激小麦根瘤细胞的DNA合成,根瘤细胞的核及DNA含量约为正常根部的二倍,2,4-D能引导上述两种根瘤菌进入小麦根瘤细胞并大量繁殖,进入根瘤细咆的根瘤菌其形态有些变化,内含聚β—羟丁酸颗粒,有些菌体被膜囊包围。从接种大豆根瘤菌的小麦根瘤内分离出一株根瘤菌,经镜检、血清学及回接大豆试验证明为原接种的大豆根瘤菌株。     

新疆地区土著根瘤菌的数值分类研究

用52株豆科植物根瘤菌(其中模式种3株,新疆地区土著根瘤菌27株和已知参比菌22株)及3株土壤杆菌,测定了形态、生理、生化、营养及抗逆性等特性,结果表明:新疆地区不少根瘤菌有其特殊性,如:耐高温(40℃),耐高盐(5％NaCl),抗高pH(pH10.72);尤其是新疆的中、慢生型菌株(光密度法测代时为5—12小时),它们能利用鼠李糖,卫矛醇,在YMA培养基中产酸,还原石蕊牛奶,并在其中产酸;有的菌株还能利用乳糖、麦芽糖、蔗糖,有几株还具有周生鞭毛,而这些特征是典型的慢生型菌株所不具备的。采用208个编码性状对这55株菌进行数值分类的结果表明:快生、慢生型根瘤菌和土壤杆菌三者在属的水平上分开,这一结果与新近出版的伯杰系统细菌学手册关于根瘤菌科的分属一致,但新疆中、慢生型菌有其特殊性,独立成群,它介于快生、慢生型之间,而更接近快生型,其确切分类地位有待扩大菌株数进一步探讨;另外,本研究还表明,快生型大豆根瘤菌很可能代表一个新的分类单元。     

磁场对大豆共生固氮的效应

恒定磁场处理慢生大豆根瘤菌“005”和接种后的大豆植株,发现磁场可以提高根瘤的固氮活性。在一定的磁场强度(70—100mT)下,固氮活性平均可以提高4—5倍,植株的结瘤数和根瘤重量平均提高2—3倍。从这样的根瘤中所分离出的根瘤菌,由慢生型转变成快生型,在100植株中有17株的根瘤分离出快生菌。生长世代时间和培养溶液中的pH值与慢生型不同,而与快生型相同。     

转座子Tn5诱变快生型大豆根瘤菌

大豆与其根瘤菌的共生固氮体系由于分布 广效率高,在农业上的意义很大。能与大豆结 根瘤的细菌有两个属：(1)慢生型大豆根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum),目前用作生产菌 剂的许多优良菌株都是这一属的成员。(2）快 生型大豆根瘤菌(Rhizobi“二f redii ),是1982 年才报道【刀的中国特有资源,具有生长速度快 的优点。大多数快生型菌株对大豆重要的生产 品种结无效瘤,但也已选出能与选育过的大豆 品种结有效根瘤的菌株[71。本文所用的USDA 19116,和马大31'1（以下简称MD     

卷荚相思根瘤菌的生物学特性

为探讨卷荚相思根瘤菌的生物学特性,从广西高峰林场卷荚相思林分采集分离到12株根瘤菌,对这些菌株进行了生理生化试验,并利用这些菌株对厚荚相思苗木进行接种结瘤试验。结果表明:(1)依据生长代时和单个菌落形成测定结果,分离获得的12个菌株可以分为9个快生菌株和3个慢生菌株。(2)大部分的供试根瘤菌菌株可以利用无机氮源作为其生长所需的氮源,但对供试用的糖源利用存在着较大的差别。(3)所有供试菌株在3一酮基乳糖反应、牛肉膏蛋白胨、淀粉水解试验中呈阴性,所有供试的12个菌株均能进行利用柠檬酸盐,在BTB试验中均产酸,在石蕊牛奶反应均产碱。(4)12个卷荚相思根瘤菌菌株接种到厚荚相思苗木后,均能使其根部结瘤,并进一步筛选出结瘤效果和固N效果比较好的供试菌株是快生型菌株(J003、J004、J005、J008)和慢生型菌株(J012)。这为从华南的酸性土壤中寻找和利用土著根瘤菌资源提供了科学依据。     

根瘤菌属胞外多糖的研究

本文研究了豌豆根瘤菌(Rhizobum Leguminosarum),苜蓿根瘤菌(R. meliloti),三叶草根瘤菌(R. trifolii),菜豆根瘤菌(R. phaseoli),豇豆根瘤菌(Rradyrhizobium sp.(Vigna))和大豆根瘤菌(R. Japonicum)产生的胞外多糖化学组分的差异,结果表明,不同种的根瘤菌能产生具有不同组分的胞外多糖,其多糖组分的差异主要表现在糖醛酸和甘露糖的含量。豌豆根瘤菌、三叶草根瘤菌,菜豆根瘤菌产生的胞外多糖含有糖醛酸,大豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌产生的胞外多糖一般不含有糖醛酸。根瘤菌有快生型和慢生型之别,这种差异也可由其产生的胞外多糖组分看到,一般快生型根瘤菌:豌豆根瘤菌,苜蓿根瘤菌,菜豆根瘤菌,三叶草根瘤菌,(包括最近证明的快生型大豆根瘤菌)的胞外多糖中甘露糖所占百分比较低(低于20％),葡萄糖所占的百分比较高(高于60％),而慢生型根瘤菌:大豆根瘤菌和豇豆根瘤菌的胞外多糖中甘露糖所占百分比较高(高于36％),葡萄糖所占的百分比较低(低于50％)。     

菌种与品种最佳组合的选育及增产效果

本文通过多年多点的田间接种试验,分析了大豆根瘤菌C_(33)(系VSDA_(110)的突变株)的增产效应.在合丰25号大豆接种C_(33)取得明显的增产效果,两年平均比CK增产28.55%,比61A76增产24.5%;C_(33)接种在其他品种以及在不同类型和肥力的土壤上增产效果也均高于CK和61A76,说明大豆根瘤菌C_(33)比当前生产上应用的61A76更具有广谱性和高效性.     

黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育

【目的】研究黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用BOX-PCR、16S rDNAPCR-RFLP、16S-23S IGS PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法对分离自我国黄土高原地区4个省的15个地区的130株大豆根瘤菌及部分参比菌株进行了遗传多样性和系统发育分析。【结果】BOX-PCR反映的菌株多样性最丰富,形成的遗传群最多,16S rDNA PCR-RFLP方法在属、种水平上聚群较好,16S-23S IGSPCR RFLP反映的多样性介于BOX-PCR和16S rDNA PCR-RFLP之间,能够较好地反映出属、种和亲缘关系很近的菌株间的差异,3种方法聚类分析结果基本一致,可将所有供试菌株分为两大类群,中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。从系统发育来看,供试的快生大豆根瘤菌为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii),慢生大豆根瘤菌为日本慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)。【结论】我国黄土高原地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii优势种,慢生大豆根瘤菌仅占10%,同时,分离到2株B.liaoningense。     

三叶草素基因(tfx)在快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)H12-2中的表达与稳定性测定

将含有三叶草条基因的重组质粒pT2TFXK和pT2TX3K以接合转移的方式导入快生型大豆根瘤菌H12－2。转移接合子H12－2（pXK）能产三叶草素并具有抑菌活性;H12－2（P3K）表现出对三叶草素的抗性。抑菌谱试验结果表明：82％的供试快生型大豆根瘤菌菌株对三叶草素敏感;所有供试慢生型大豆根瘤菌则表现抗性。稳定性检测结果表明：在共生与人工培养条件下,导入的pXK和p3K质粒均可在宿主菌中稳定存在和表达。     

快生型大豆根瘤菌和大豆品种不同土壤类型对结瘤的相互影响

胡济生教授和H.Keyser1982发表了从中国中部土壤中分离到快生型大豆根瘤菌。当时由于快生型大豆根瘤菌在美国栽培大豆上不结瘤,只能在中国北京黑豆上结瘤,因此,快生型大豆根瘤菌能否在栽培大豆上结瘤和大豆品种间的关系如何引起了人们的重视和研究。1983～1987年很多研究报导了在人工接种条件下快生型大豆根瘤菌能在某些栽培大豆     

紫色非硫光合细菌与大豆根瘤菌固氮作用的协同效应

从东北地区水稻及大豆根际分离出的两株紫色非硫光合细菌(球形红假单胞菌菌株N8611和胶质红假单胞菌菌株N84),分别与快生型大豆根瘤菌QB113以及慢生型大豆根瘤菌B16—11C共同培养时,其固氮比活与它们的纯培养菌相比有显著提高,说明这两类菌的固氮活性具有协同效应。两株光合细菌及其胞外组分,以及光合细菌与大豆根瘤菌共同培养时分离出的胞外组分,能显著加强由上述根瘤菌所形成根瘤的固氮活性。可以初步肯定,上述协同效应的原因之一是光合细菌胞外组分的刺激作用。     

转座子Tn5诱变快生型大豆根瘤菌

大豆与其根瘤菌的共生固氮体系由于分布广效率高,在农业上的意义很大。能与大豆结根瘤的细菌有两个属:(1)慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum),目前用作生产菌剂的许多优良菌株都是这一属的成员。(2)快生型大豆根瘤菌(Rhizobium,fredii),是1982年才报道的中国特有资源,具有生长速度快的优点。大多数快生型菌株对大豆重要的生产     

海南省根瘤菌资源考察及分类

对海南省各地区的豆科植物进行了根瘤菌共生情况调查和根瘤样品采集。经分离、纯化和回接试验后,选取了其中38株菌与Rhizobium、Bradyrhizobium、Sinoorhizobium和Agra-btcterium四属的18株参比菌进行了193个生理生化性状分析,使用简单匹配系数(ssm)和平均连锁法(UPGMA)进行了聚类分析,同时对部分菌株做了DNA—DNA杂交分析及交叉结瘤试验。结果表明,海南省根瘤菌被分为快慢两群,自同一寄主植物属既分离出快生根瘤菌又分离出慢生根瘤菌。海南省慢生根瘤菌全属于Bradyrhizobium群,该群在88％相似性水平分为三个亚群,相当于亚种水平。慢生菌在亚群中的分布与原寄主无相关性,即同一寄主的菌分布在不同亚群中。海南快生菌却独立成群,在碳氮源利用、抗生素抗性及其它生理生化特性上与海南慢生菌群和快生参比菌群均显著不同,值得进一步研究,以确定其分类地位。     

神木地区耐旱灌木和草本豆科植物根瘤菌遗传多样性

豆科植物具有抗逆性强、耐瘠薄的特性,许多豆科植物是荒漠地区的先锋植物,在生态环境保护中起重要作用.以神木地区主要的灌木和草本豆科植物-根瘤菌共生体系为材料,采用16S rRNA PCR-RFLP和序列分析等方法,对分离得到的55株菌进行多样性分析,其中,30株菌分离自灌木豆科植物紫穗槐和柠条,25株菌分离自草本豆科植物斜茎黄芪、苜蓿、草木樨黄芪等.结果表明: 这些菌株共有11种16S rRNA PCR-RFLP遗传图谱类型,分离自草本豆科植物的菌株主要归属于中慢生根瘤菌属、剑菌属、根瘤菌属、叶瘤杆菌属和土壤杆菌属5个属,分别与华癸中慢生根瘤菌、地中海中慢生根瘤菌、刺槐中慢生根瘤菌、费氏剑菌、草木樨剑菌、木兰根瘤菌、放射根瘤菌、突尼斯叶杆菌和根癌土壤杆菌系统发育关系最近.分离自灌木豆科植物的菌株仅归属于中慢生根瘤菌属,分别与华癸中慢生根瘤菌和地中海中慢生根瘤菌系统发育关系最近.华癸中慢生根瘤菌和地中海中慢生根瘤菌是两类豆科植物的共生菌种,表明在干旱地区,根瘤菌对两种类型豆科植物的选择共生存在差异,这与豆科植物种类有关,还可能与其所处生态环境有关.