高通量筛选在抗病毒药物筛选中的应用

高通量筛选(high throughput screening, HTS)是以分子和细胞水平的实验方法为基础,在微孔板上以自动化操作系统执行实验过程,通过灵敏快速的检测仪器采集实验数据、运用计算机对实验数据进行实验结果的分析处理.因此HTS具有大量样品的快速筛选、分子和细胞水平的特异性作用靶点、检测系统的高灵敏度、自动化操作系统和数据采集传输处理系统等优点.     

膜片钳技术的新进展及其在药物高通量筛选中的应用

作为先进的细胞电生理技术,膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明,以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的针对离子通道为靶标的药物研发的瓶颈,近年来,对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的需求,由此产生了一些新的技术。本文就最近几年膜片钳技术的新进展及其在药物高通量筛选中的应用进行了综述。     

基于酵母水平的高通量药物筛选

随着后基因组时代的到来,越来越多的药物靶标蛋白将会被发现,基于靶标蛋白设计出的化合物也将大量涌现,高通量药物筛选日趋重要。酵母基因组的易操作性及其简单稳定的培养条件,使得该真核微生物成为一种理想的药物筛选工程细胞。本文讨论了选择酵母系统进行细胞水平筛选的优缺点,并从基于靶点和表型两种筛选模式对酵母水平的高通量药物筛选做一总结。     

药物筛选新方法--高通量筛选

介绍了高通量筛选的概念、原理及其各个组成部分,着重阐明了高通量筛选的筛选模式,检测方法和应用实例,并简单介绍了国内在这方面的研究进展。     

几种高通量定向筛选技术及其比较

在定向进化过程中,多样性的突变文库一旦构建好后,实验成败与否的关键就在于建立针对目的改造特征的高通量筛选方案。从突变文库中筛选需要的、功能进化的目的基因,关键在于是否有一种或几种高通量筛选技术。介绍了几种目前常用高通量定向筛选技术的基本原理,并对其特性进行了比较。     

高通量技术在萜类合成酶筛选中的应用

萜类化合物种类繁多,生物活性多样,在食品、药品与化妆品等行业中具有广泛的应用。萜类化合物多来源于植物,然而随着合成生物学的快速发展,相较于传统的天然植物提取与化学合成方法,利用工程微生物进行萜类化合物异源合成的方法显得更为经济与环保。萜类合成酶的催化活性及合成产物的结构特性是萜类化合物异源合成的关键。通过蛋白定向进化与理性设计可以有针对性地优化萜类合成酶的催化性能及产物专一性,但该方案需要一个特异的筛选方法来实现蛋白突变体库的高通量筛选。近年来,一系列高通量筛选方法的建立使得萜类合成酶的筛选变得更加灵敏与高效。本文对近期建立的萜类合成酶高通量筛选方法进行了综述,简要概述了各种筛选方法的基本原理与优缺点,并对高通量筛选技术在萜类合成酶改造中的应用做出了展望。     

高通量筛选瞬时受体势V3通道调节剂细胞模型的建立

为发现TRPV3调节剂,通过荧光成像分析系统检测钙浓度,建立高通量筛选瞬时受体势V3通道(Transient receptor potential V3,TRPV3)调节剂的细胞模型.将TRPV3表达载体转染人胚肾(HEK-293)细胞,抗生素筛选稳定表达TRPV3的细胞系,选取TRPV3特异性调节剂作用于细胞模型,应用荧光成像分析系统测钙实验检测TRPV3高表达细胞系药理学特征,同时优化实验条件,考察模型的稳定性,并评估应用于96孔板及384孔板进行高通量筛选的可靠性及准确性.获得了高表达TRPV3的HEK-293稳定细胞系,通过TRPV3离子通道调节的钙流信号与TRPV3特异性调节剂成剂量依赖关系,优化得到了最适筛选条件,该模型稳定,灵敏,通过Z因子及Spiking检测,完全符合高通量筛选需求.利用此细胞模型通过检测钙信号可筛选TRPV3调节剂.     

高通量筛选工具的设计与应用

定向进化方法作为新兴的高效蛋白质工程手段,其内容包括蛋白质突变体文库的构建和有效突变体的快速筛选。高通量筛选方法是定向进化方法的重要组成部分,是成功获得有效突变体的关键。筛选的突变体数量越多,获得有效突变体的几率越大。以下介绍了目前已经成功应用于或有潜力应用于定向进化改造蛋白质的几种高通量筛选工具。高通量筛选工具的不断设计与开发将推动蛋白质工程领域的技术革新。     

创新药物体外ADMET 的高通量筛选技术研究进展

目前的新药研发策略已从传统的以活性为主导的筛选模式,转变为在测定药效的同时平行评价化合物的ADMET性质,并建立了系列体外ADMET高通量筛选技术。本文综述了近年来药物体外ADMET高通量筛选技术的研究进展。     

适用于高通量筛选的脂肪酶表达系统

突变库容量和高通量筛选方法是影响酶分子定向进化的两个决定因素,虽然巴斯德毕赤酵母pPIC9K表达系统已被广泛使用[1],但由于外源基因可通过单插入整合入基因组,产生多拷贝突变基因,从而干扰后续重组子的筛选;另一方面,pPIC9K表达系统需要甲醇诱导,需要每日补加甲醇来诱     

代谢型谷氨酸受体5亚型高通量筛选模型的建立

目的: 利用荧光测钙的方法,建立了人源代谢型谷氨酸受体5亚型(mGluR5)的高通量筛选模型。方法: 通过基因合成得到mGluR5的ORF区域,并将其构建到pCNDA3.1真核表达载体上。将此重组质粒转染HEK293细胞,利用抗生素筛选和钙流检测方法得到稳定表达mGluR5的重组细胞株。结果: 对试验条件:接种密度,孵育时间,溶剂DMSO浓度进行了优化,建立了稳定可靠的实验系统。并使用该受体特异激动剂和拮抗剂进行了功能验证,其中激动剂EC50 L-Quisqualic acid(67.8nmol/L) > L-Glu(2.73μmol/L),抑制剂IC50 MTEP(3.3nmol/L) > Fenobam(23.5nmol/L)系统Z因子为0.68,证明建立了一个人源mGluR5抑制剂的细胞筛选模型。利用此重组细胞株对360种化合物进行了筛选,找到了若干对mGluR5有抑制效果的化合物。结论: 此细胞模型适用于mGluR5抑制剂的高通量筛选。     

黑色素皮质素受体激动剂的高通量筛选模型研究

为了建立黑色素皮质素受体（MC4R）激动剂的高通量筛选方法,将人的MC4R基因质粒（hMC4R/pCDNA3.1）与报告基因质粒（3×CRE/3×MRE/SRE-LUC）按1∶5的比例共转染到HEK293细胞,通过G418筛选,建立了稳定的MC4R激动剂筛选细胞株.利用MC4R内源激动剂α-MSH探索和优化了每孔接种细胞数目、激动剂孵育时间、溶剂DMSO终浓度、荧光素酶底物浓度等筛选条件,建立了可靠的筛选方法.实验表明：当细胞数目为4×10⁴个/孔,激动剂孵育时间为8 h,每孔DMSO终浓度小于1％和α-MSH终浓度为1 μmol/L时,系统Z'-因子接近0.7,能够用于MC4R激动剂的高通量筛选.     

谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用

目的:建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法,并用于大肠杆菌氨基转移酶Wec E突变库的筛选。方法:通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间,建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法;通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库;采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体,并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果:建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法;构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库,通过96孔板高通量筛选,获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论:所建立高通量筛选方法背景干扰小,准确性高,为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。     

酰胺酶高通量筛选方法研究进展

酰胺酶是一种合成手性羧酸和酰胺衍生物的重要工具酶,在不对称合成中具有巨大应用潜力.传统的色谱分析方法通过检测底物及相应的产物去测定酰胺酶活性及立体选择性,十分费时费力.根据显色法、荧光法、NMR等原理,较为全面地综述了近年来国内外发展起来的高通量酰胺酶筛选方法.为酰胺酶筛选中筛选效率低、可靠性差等难题提供借鉴,也可为其他水解酶筛选模型的建立提供思路.     

An Assay Suitable for High Throughput Screening of Anti-Influenza Drugs

We developed a novel drug screening system for anti-influenza A virus by targeting the M2 proton channel. In the SPP (Single Protein Production) system, E. coli cell growth occurs only in the presence of effective M2 channel inhibitors, and thus simple measurement of cell growth was used as readouts for drug screening. Two potential inhibitors for M2 (V27A) mutant were verified using this method, which inhibit both the mutant and wild-type M2 channels.     

Complement C5a Receptor Assay for High Throughput Screening

Abstract

The complement C5a receptor on U937 cells, a human histiocytic lymphoma cell line, stimulated with dibutyryl-cAMP have been stabilized for at least 3 months at a diluce, ready to use concentration. [¹²⁵I]-Bolton Hunter labeled C5a, (recombinant, human) has been prepared by reverse phase HPLC to 2200 Ci/mmol. Using a filtration binding assay the Kd from receptor saturation analysis is 10–40 pM and there are 50,000–100,000 receptor sites per cell. These reagents have permitted the development of a reliable, reproducible and convenient drug screening assay, in kit format, for compounds acting at the C5a receptor.     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂高通量筛选模型建立和应用

本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase,PTP1B）作为靶点,采用分子克隆GST融合蛋白的方法,重组表达获得PTP1B,结合自动化操作技术和比色分析,建立了一种PTP1B抑制剂的高通量筛选模型.经在96孔板优化各种反应条件并对17940个样品的筛选结果表明,靶向PTP1B建立的高通量筛选模型具有微量、快速、特异、灵敏等特点,平均日筛选量可达15000样次以上,为寻找新的抗糖尿病药物和先导化合物提供了一种先进的手段.     

高通量药物筛选技术的研究现状及光学编码技术在其中的应用

高通量药物筛选是创新药物研究的重要内容,本文综合介绍了高通量药物筛选的研究现状及发展趋势,及目前遇到的一些问题,如随着样品的体积达到微升量级时,目前所采用的孔板筛选遇到了一些难以克服的障碍,使化合物和药物靶点的相互作用难以进行等。针对这些问题,本文介绍了一种新的以自编码光谱识别微球为基础的新型高通量药物筛选技术在高通量药物筛选中的应用,同时简要介绍了我们目前所做的一些工作。