高通量筛选孤儿受体和膜结合配体的MACS/FACS方法的建立

本文报道了一种用于分离、筛选孤儿受体和膜结合配体的高通量的表达克隆系统(expression cloning system).该系统是以高效表达的逆转录病毒载体为核心,以高通量的磁力分离法（magnetic cell sorter,MACS）和高精确度分选型流式细胞仪（FACS）相结合的独特的筛选方法.具体方法是将配体通过生物反应对固定在磁粒上 （如biotin/streptavidin, Fc/protein A等）.该磁粒的特点是非常微小,相当一个病毒颗粒.当配体蛋白结合到表达受体的BaF3细胞上时,该细胞将停留在MACS磁场中,从而与非受体表达细胞分开.MACS的优点是效率高,可同时操作上亿细胞.这些细胞是无法直接在分选型流式细胞仪上操作的.当这些阳性细胞增殖后,再次用同一配体染色,用更精确的分选型流式细胞仪分离,直至完全纯化.受体基因将用PCR方法,用载体引物克隆.利用该系统可以从1000 000个细胞中筛选出低至2个表达配体/受体的阳性细胞.为验证该系统的可行性,应用该系统在相应的cDNA文库中筛选到2个已知基因的细胞受体.应用诱饵B7-1从人T淋巴细胞cDNA文库中筛选其功能受体CD28.应用B7-H2作为诱饵,从活化的人T淋巴细胞cDNA文库中筛选到ICOS.最终,从纯化的受体表达细胞中分离出受体的cDNA编码序列.这些结果表明,改进的表达克隆系统适合于大规模分离孤儿受体和膜结合配体,以及在后基因组时代用于研究新蛋白的功能.     

猪T细胞受体γ链基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆猪T细胞受体γ链(pTCR-γ)基因,用以研究猪T细胞受体分子结构与功能。方法与结果:以GenBank上登载的pTCR-γ基因为参考序列,用RT-PCR法从猪外周血淋巴细胞中克隆pTCR-γ基因。序列分析表明,pTCR-γ基因开放读框为1026bp,编码341个氨基酸残基,含有由23个氨基酸残基构成的信号肽序列;与参考序列相比,在核苷酸和推导氨基酸序列上的同源性分别为95.6%和88.8%;系统进化分析发现,该基因与绵羊、恒河猴、人、马、牛的同源性相对较高,与褐鼠、家犬、家鼠、家猫的同源性次之,而与禽类、鱼类的同源性最低;生物信息学结构预测表明猪T细胞受体γ链含2个结构域,其中1个为IG_LIKE1结构域(IGv结构域),由第14～114位共101个氨基酸残基组成;另一个为IG_LIKE2结构域(IGc结构域),由第143～238位共96个氨基酸残基组成。结论:克隆并应用生物信息学技术分析了猪T细胞受体γ链基因序列及编码蛋白的结构特征,为进一步研究γ链的结构与功能奠定了基础。     

TCR基因重排在T淋巴细胞浸润亲表皮疾病中的应用

目的:探讨具有亲表皮现象的疾病T细胞受体γ链基因重排的情况.方法:用免疫组化标记筛选17例T细胞淋巴瘤、30例可疑为T细胞淋巴瘤和10例副银屑病,采用聚合酶链式反应扩增方法检测T细胞受体γ链基因重排.结果:17例T细胞淋巴瘤中12例出现T细胞受体γ链基因重排,30例可疑为T细胞淋巴瘤和10例副银屑病均无T细胞受体γ链基因重排.结论:T细胞受体γ链基因重排检测是区分T淋巴细胞浸润的亲表皮疾病鉴别诊断的有效方法,且对T细胞淋巴瘤的确诊有重要参考价值与显著意义.     

TCR基因重排在蕈样肉芽肿诊断中的应用

T细胞在成熟过程中通过T细胞表面受体基因重排,从而具有特异性识别抗原的能力,在这一过程中的任何失调都会导致疾病。蕈样肉芽肿是由于淋巴细胞的恶性增殖所导致的,病变组织表现出T细胞受体基因重排克隆性。通过Southern印迹分析技术和PCR技术来检测T细胞受体基因重排。T细胞受体基因重排的检测在蕈样肉芽肿的诊断的应用上有重要的参考价值。     

Cell Metab:改善睡眠的保健品可能增加糖尿病患病风险

正近日,来自瑞典隆德大学糖尿病中心的研究人员在国际学术期刊Cell Metabolism上发表了一项最新研究进展,他们发现胰岛细胞中褪黑素信号增强会降低胰岛素分泌,可能导致高血糖症并增加2型糖尿病患病风险。目前2型糖尿病逐渐成为一种全球性公共健康问题,其流行趋势越来越严重。全基因组关联性分析已经发现了超过100个与糖尿病有关的变异基因,其中包括一个比较常见的变异基因--MTNR1B(褪黑素受体1b)。MTNR1B能够增加细胞对褪黑素的敏感性,但该基因在胰岛细胞中     

Nature子刊:科学家开发出可"观察"机体T细胞调节机制的新型工具

正近日,发表在国际杂志Nature Biotechnology上的一篇研究报告中,来自新南威尔士大学的研究人员通过研究开发出了一种新型传感器,其能够测定机体T细胞的膜电荷;T细胞是机体免疫系统的"大脑",因此理解T细胞如何感知并且对抗原产生反应非常重要。截至目前为止,研究人员并不清楚结合到T细胞受体上的抗原如何诱发细胞胞内的激活反应,或者当受体并未同抗原结合时其不会产生信     

肺泡型细胞内表皮生长因子和转化生长因子α、β_1及其受体基因表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡 型细胞 ,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色 ,研究肺泡 型细胞内表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子 α和 β1 (TGFα、TGFβ1 )及其受体基因的表达。结果显示肺泡 型细胞可表达 EGF、TGFα和TGFβ1 ,也可表达相应的 EGF受体 (EGFR)、TGFβ受体 型和 型 (TβR 、TβR )。表明肺泡 型细胞是合成和分泌 EGF、TGFα和 TGFβ1 的细胞之一 ;细胞凭借其 EGFR、TβR的存在 ,其增殖与分化可能受 EGF、TGFα和 TGFβ1 的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

肺泡Ⅱ型细胞表皮生长因子和转化生长因子α、β1及其受体表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡Ⅱ型细胞,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色,研究肺泡Ⅱ型细胞内表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α和β1（TGFα、TGFβ1）及其受体基因的表达。结果显示肺泡Ⅱ型细胞可表达EGF、TGFα和TGFβ1,也可表达相应的EGF受体（EGFR）、TGFβ受体Ⅰ型和Ⅱ型（TβRⅠ、TβRⅡ）。表明肺泡Ⅱ型细胞是合成和分泌EGF、TGFα和TGFβ1的细胞之一;细胞凭借其EGFR、TβR的存在,其增殖与分化可能受EGF、TGFα和TGFβ1的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

细胞分裂时的组蛋白密码

<正>是繁殖还是死亡,这是一个基因最根本的功能.没有任何生命可以永生,因而唯有繁殖才是生命得以延续的方法.而一个细胞的分裂复制,也就是有丝分裂,则是这一过程的根本所在.来自洛克菲勒大学的研究人员揭示了组蛋白修饰在有丝分裂中的重要作用,并将成果发表在Science杂志上.他们向我们展示了在细胞完成分裂之前,新合成的染色质分离并向细胞两极运动这一重要的过程是如何被精细调控的。     

用花药愈伤组织作为转化受体的水稻转基因植株的分析

以花药愈伤组织作为转化的受体材料,利用农杆菌介导法将已克隆的Xa21基因导入粳稻栽培品种台北309中。共获得7个转基因株系,其中2个单倍体,4个二倍体,1个混倍体。PCR、Southern、FISH以及白叶枯病抗性的分析结果都表明．Xa21基因已整合到T0代受体基因组。调查了4个二倍体株系T1代的分离情况,经x^2测验证明,有2个株系的分离比为3：1,为单拷贝插入,另外2个株系不符合孟德尔分离。4个T0代二倍体转基因株系应为杂合二倍体。     

发现舌头上的两个味觉受体

马里兰Ｂｅｔｈｅｓｄａ的牙齿与颅面国家研究院的ＮｉｃｈｏｌａｓＪ．Ｐ．Ｒｙｂａ领导的研究组与圣地亚哥的加州大学ＨｏｗａｒｄＨｕｇｈｅｓ医学中心的ＣｈａｒｌｅｓＳ．Ｚｕｋｅｒ领导的研究组在２月１９日的《Ｃｅｌｌ》上报道他们合作鉴定了舌头上两个味觉受体。舌前部散布着象小岛一样的味蕾上集中了带有味觉受体的味觉细胞。１９９６年曾发现感觉肉鲜味的味觉受体。Ｚｕｋｅｒ研究组与Ｒｙｂａ研究组分析了舌前部味觉细胞的基因活性，他们筛选了数以百计的活性基因，发现了一个称为ＴＲ１的基因，它编码有点象谷氨酸与信息素受体…     

替代性转化:一种新的遗传工程技术

Massey 大学和新西兰 DSIR 的研究人员描述了一种把外源基因导入植物的新方法。他们不是把外源DNA 导入并表达在植物细胞本身,而是导入并表达在生活在植物体内的内生植物真菌里。研究人员利用β-葡糖苷酸酶基因成功地转化了多年生黑麦草内寄生菌 Acremonium(主要存在于其     

Nat Commun:T细胞信号转导过程在免疫反应中起着关键性作用

正被称作T细胞的免疫细胞在身体抵抗感染和癌症的能力中发挥着至关重要的作用。然而,几十年来,导致T细胞活化的分子信号转导过程的详细信息仍然是一个谜。在一项新的研究中,来自美国国家卫生研究院和加州大学圣克鲁兹分校的研究人员首次描述了T细胞受体识别一种抗原(如病毒蛋白)从而触发导致一种免疫反应的前几个步骤发生的机制。相关研究结果在线发表在     

LDL受体基因cDNA的RT—PCR分离,克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａＩ片段的作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕＩ位点是个限制性片段长度多态性位点,所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全     

B细胞免疫球蛋白与T细胞抗原受体基因的种系结构及其体细胞重排(续)

T细胞受体基因 以~(125)Ⅰ标记的抗原测试T细胞,发现T细胞能与抗原结合,在放射活性很高时被杀灭,余下的T细胞就不再能结合此种抗原。这提示T细胞也具有抗原受体,且有克隆多样性。但对TCR的本质多年来捉摸不定,推测也是一种Ig样分子,故称之为IgT或Igx。1983年同时有几个实验室制备了与TCR反应的克隆特异性抗体。1984年以来相继克隆了TCR基因的     

基因技术让免疫器官“返老还童”

<正>英国爱丁堡大学再生医学中心的研究人员报告说,他们利用基因技术使老年实验鼠的重要免疫器官"胸腺"功能得到恢复。研究人员认为,这项成果对于再生医学发展有广泛意义。胸腺位于心脏附近,主要负责产生T细胞、分泌胸腺素和激素类物质等。伴随着年老体衰,胸腺会逐渐变小、功能退化,导致机体免疫功能下降。英国爱丁堡大学再生医学中心的研究人员发现,随着胸腺逐渐老化,一个名为"Foxn1"的基因在自身表达方面会逐渐偃旗息鼓。在动物实验中,他们利用一种药物来调节实验鼠的     

CAR-T 对肿瘤的特异性治疗研究进展

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T疗法)是一种治疗肿瘤的新免疫疗法,通过向患者自身T细胞中导入已被修饰的CAR基因,使T细胞表达结合肿瘤表面抗原的特异性受体来实现对肿瘤的精准治疗.目前已发展到第四代.该免疫疗法在血液瘤和实体瘤治疗中都有一定疗效,同时也存在一些待解决难题.本文就近年来CAR-T在血液瘤和实体瘤中的研究治疗进展及存在的问题进行综述.     

Cell metabolism:新发现,调节淋巴样细胞发育的RORγ天然配体

近日,著名国际代谢类杂志cell metabolism刊登了纽约大学医学院研究人员的一项最新研究成果,他们通过实验证实了核激素受体RORγt的天然配体是胆固醇合成过程中的中间产物,并且发现了RORγt配体影响淋巴细胞发育的具体机制。研究人员指出,核激素受体RORγt缺失小鼠会出现胸腺细胞,淋巴器官,Th17和ILC3细胞发育缺陷,之前研究发现RORγt能够结合胆固醇代谢产物羟固醇,但这些是否是RORγt的天然配体仍不清楚。研究人员利用过表达,RNAi,以及对代谢酶进行基因敲除等方法对RORγt依赖性     

LDL受体基因cDNA的RT－PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａⅠ片段作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全部密码,因此可作为基因表达材料。     

一个新的OsBRI1弱等位突变体的鉴定及其调控种子大小的功能研究

水稻(Oryzasativa)籽粒大小是影响其产量的关键农艺性状,克隆并研究水稻籽粒大小相关基因对于提高水稻产量具有重要意义。为深入探究水稻籽粒大小的调控机制,通过EMS诱变品种宽叶粳(KYJ),分离了一系列水稻籽粒大小改变的突变体,其中smg12表现为籽粒变小,株高变矮,一级枝梗数和二级枝梗数减少。遗传分析表明,该小粒突变体受隐性单基因控制。细胞学分析显示,该突变体颖壳纵向细胞长度显著变短,表明SMG12主要影响细胞扩展。利用Mutmap方法对候选基因进行克隆,筛选出SMG12的候选基因OsBRI1,该基因编码油菜素内酯受体激酶。OsBRI1外显子上的第2 074个碱基发生了由C到T的置换,产生非同义突变,使得该位置编码的脯氨酸变为丝氨酸,从而影响OsBRI1的功能。综上,该研究鉴定了OsBRI1基因的1个新等位变异,揭示了油菜素内酯途径调控水稻籽粒大小的细胞和分子基础。