人抗药基因在小鼠ES细胞中的表达及嵌合体小鼠的研究

本文用磷酸钙沉淀法将含人ｍｄｒ１基因表达质粒转染到小鼠胚胎干细胞,得到了四个能稳定地在含有２００ｎｇ／ｍｌ秋水仙素培液中生长传代的细胞克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交及ＲＮＡ印迹杂交证明人ｍｏｄｒ１基因已整合到ＥＳ细胞基因组,并有表达。其中两个克隆杂交信号较强,抗药基因可随秋水仙素深度提高而扩增,表达量也随之增加。用抗该基因编码的ｐ１７０糖蛋白抗体对ＥＳ－ｍｄｒ １细胞作免疫荧光染色,证实ｐ１７０     

外源TGF-β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Dol,在其BamHⅠ酶切位点插入猪TGF-β1的1.7kbcDNA,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒DNA转染到小鼠ES-5细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的ES-5细胞克隆(ES-T),经RNA点杂交,Northern印迹杂交证明有6个细胞克隆能表达外源猪TGF-β1的mRNA,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Southern印迹杂交,也证明猪TGF-β1基因已整合到ES-5细胞基因组。经SELISA和生物活性测定,证明ES-T细胞存在着过度表达的TGF-β1基因产物。ES-T细胞生长特性与其亲代ES-5细胞相比,未发现明显差异。经低浓度RA处理悬滴培养的ES-T6细胞,将形成的拟胚体移至用白明胶铺底的培养板中,则最终有95%左右的拟胚体分化出血管样结构,而ES-5细胞在相同培养和处理条件下,只有17.8%形成无规则的管状结构,这结果提示ES-T6细胞基因组中外源TGF-β_1的额外表达,在调节该细胞株分化形成血管样结构中起着重要作用。同时,我们的实验体系也提供了一个适合于研究内皮细胞发生和血管形成的模型。     

具高效种系嵌合能力的C57BL／6J 小鼠ES细胞系的建立

采用小鼠原代成纤维细胞作为饲养层,在含1×103单位白血病抑制因子（LIF）的DMEM高糖培养基中,建成了11个C57BL／6J小鼠的ES细胞系,成系率为9．6％。所建的11个ES细胞系中有5个核型正常率大于70％。这些细胞具早期胚胎细胞的特征,呈碱性磷酸酶阳性,具表达0014基因的特性5进行体内分化实验时能发生广泛的分化。通过嵌合体制作实验证明其中3个系具嵌合能力,并从中筛选出具高效种系嵌合能力的MESPU35细胞系,MESPU35细胞的克隆能达到种系传递,经过基因操作的细胞克隆,也保留了高效的嵌合能力。因此,MESPU35细胞可作为制作突变小鼠的有效载体。     

维生素A酸受体γ基因表达及其对ES细胞分化和凋亡的影响

本文以小鼠胚胎干细胞ES-5细胞为实验模型,研究了RARγ基因表达对RA诱导ES细胞分化的影响。通过把构建质粒pSG5-RARγ-neo转染ES-5细胞,获得了过度表达RARγ基因的ES-γ细胞系。ES-γ细胞保持了ES细胞的干细胞特点。体内分化潜能的研究表明,ES-γ细胞仍然保持分化多潜能性的特点,能分化形成各种组织结构,但与ES-5细胞相比,观察不到软骨组织,而肌肉组织和鳞状上皮细胞构成的角质化囊状结构较丰富。体外诱导分化研究表明,ES-γ细胞分化方向受到干扰,向成纤维样细胞分化。这些结果表明RARγ基因参与了RA诱导ES细胞分化的过程,而且RARγ基因的表达变化影响了RA诱导ES细胞分化的细胞类型。在研究中还发现,ES细胞在RA诱导分化过程中,同时还发生了细胞凋亡现象。细胞凋亡的发生与RA浓度相关,而RARγ基因的过度表达使细胞凋亡明显加剧。这些结果表明RARγ基因可能也参与了RA诱导ES细胞凋亡的过程。     

一个小鼠未分化胚胎癌细胞特异cDNA的分子克隆

用胚胎癌细胞株(EC)PCC_3,的poly(A)~+RNA及质粒pBR 322在大肠杆菌中建立了一个eDNA文库。用另一株EC细胞F(?)及由EC细胞衍生的分化细胞株滋养层母细胞癌TDM_1的~(32)PcDNA作探针,对PCC_3 eDNA文库作了差别筛选。自3,000个cDNA克隆中筛出25个克隆。其中1个克隆MS,含有长250bp的cDNA。用MS,cDNA作探针,在F(?)细胞中能检出1个占poly(A)~+RNA约0.2—0.4％、长6kb的RNA(MS_3RNA)。用点印迹杂交及Northern印迹杂交分析法,证明MS_3RNA还存在于供试的另2株未分化EC细胞株PCC_3、PSA_1-NG_2中。在供试的全部分化细胞株,即TDM_1、PSA_1-2、3/A/1-D3、C_(17)-S_1-T(284)中,均查不到MS_3RNA。用Southern印迹杂交分析法,证明MS_3基因在小鼠基因组中存在着大量的拷贝,对小鼠胚胎基因文库的筛选表明,MS_3基因有一个中等重复的基因家族,这个家族在小鼠基因组中约有3,000个成员。     

维生素A酸和双丁酰基环腺苷单磷酸对小鼠胚胎干细胞的诱导分化

我们用建系的小鼠胚胎干细胞ES-5细胞为材料,研究了维生素A酸(RA)和双丁酰基环腺苷单磷酸(dBcAMP)对该胚胎干细胞的体外诱导分化。在ES-5细胞单层培养的条件下,RA单独作用或RA与dBcAMP共同作用,都产生神经元样和成纤维样两种细胞;在后一种作用情况下分化细胞可达90—95%,通过对细胞形态特征表型标志(GFAP,层粘蛋白等)的分析,初步证明绝大部分细胞为神经胶质细胞。除单层培养外,我们还研究了RA对ES-5细胞聚集体贴壁培养的诱导分化,在这种条件下,分化细胞类型较多,其是最突出的是有节律收缩的心肌样细胞。本文讨论了ES-5细胞单层培养与细胞聚集体贴壁培养两种条件下,RA诱导的差异及其可能原因。     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的：应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论：重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒,电穿孔转染小鼠ES细胞,筛选阳性克隆.诱导ES细胞向脂肪细胞分化,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式.结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达,从EB形成的第3天开始表达,直至脂肪细胞分化完成.该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达.首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索.     

ES细胞分化为血管样结构的机理探讨—TGF-β1在血管形成中的作用

本文利用小鼠ES细胞的拟胚体培养和三维胶原蛋白培养系统研究了外源rhTGF-β1对ES细胞分化为血管样结构的影响。结果发现,无论是培液中添加外源rhTGF-β1或细胞经基因转染而有过度表达的TGF-β1都对ES细胞形成血管样结构起着决定性的作用。培液中添加适量的TGF-β1抗体,则过度表达TGF-β1的ES-T6细胞分化为血管样结构的频率明显地受到抑制,相似于其亲本ES-5细胞的分化水平。在Ⅰ型胶原三维培养系统中的单层ES-5细胞培液中添加rhTGF-β1时,明显地促进ES-5细胞形成血管样结构。用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白抗体分别作免疫荧光染色也观察到ES-T6细胞分化产生的上皮样细胞和圆形细胞都显示较强的荧光反应,这些现象提示TGF-β1可能通过调节细胞外基质成份而行使其在血管形成中的作用。同时,我们在ES-5细胞和ES-T6细胞的分化衍生物中都检测到bFGF的mRNA。因此,TGF-β1在血管样结构形成中的作用,除了它对于细胞外基质成份有关基因的直接调控外,还可能通过调节细胞的bFGF等一类与血管内皮细胞生长和分化相关的生长因子而间接地行使其生物学功能。在本实验系统中,ES-T6细胞分化为内皮细胞及血管样结构必需有低剂量RA的诱导,其作用机理有待研究。     

小鼠对天花粉蛋白体内及体外免疫应答的基本特点

C 57 BL/6 J小鼠在应用弗氏全佐剂或铝矾为佐剂结合天花粉蛋白免疫后都能引起抗原特异的IgE类抗体的反应以及其它Ig类抗体的反应;IgE的滴度和总的抗天花粉蛋白抗体的滴度的动态变化趋势基本一致,但并不完全同步。IgE类上升得较IgG等类抗体为慢,但上升的速度要快。脾和肠系膜淋巴结细胞分泌抗体的动态变化也和血清并不完全一致。天花粉蛋白在一定浓度下能抑制小鼠T淋巴细胞在体外的抗原特异的增殖反应和ConA反应。这抑制并不限于增殖过程的启动。补充外源性的IL-2也不能消除这抑制作用。天花粉蛋白加热变性后丧失了对小鼠淋巴细胞的毒性,并能引起经未变性天花粉蛋白体内致敏的小鼠的T淋巴细胞在体外的明显增殖。应用微量的天花粉蛋白为抗原,以及少量的无凝集素的conA条件培液等能在体外诱发致敏的B淋巴细胞产生二次抗体应答。     

对果蝇S期细胞内组蛋白基因的原位定量分析

利用微型计算机控制的荧光显微镜、荧光强度检测仪和图像记录装置并结合荧光原位杂交法对果蝇细胞核内组蛋白基因的复制时期进行了研究,从而建立了一套细胞内直接定量分析的方法。根据果蝇胚胎原代培养细胞核的DAPI染色强度确定处于S期的细胞。用杂交信号的荧光强度与细胞核荧光强度的相关关系来反映组蛋白基因的复制时期。结果表明果蝇组蛋白基因的复制是在DNA合成早期进行的。这套方法至少可直接在细胞上对每套基因组100以上拷贝数的熏复DNA序列进行有效的定量分析。     

内分泌细胞中溶酶体对激素分泌调节的作用

本实验用外源性雄激素引起垂体促性腺激素细胞和睾丸间质细胞分泌抑制,对这两种细胞中的溶酶体及分泌吞噬和自体吞噬活动进行了超微结构形态观察和半定量分析。实验中应用了CMP酶细胞化学技术和免疫胶体金技术。研究结果显示,在分泌受抑制状态下,垂体促性腺激素细胞中溶酶体增多,分泌吞噬活动加强;与此同时,睾丸间质细胞也表现溶酶体增多、自体吞噬活动加强。这些结果不仅再次证明在分泌蛋白质激素细胞中溶酶体以分泌吞噬的方式参与了激素分泌调节,更重要的是初步证明在分泌类固醇激素细胞的分泌调节中,也有溶酶体的参与,其形式是自体吞噬作用。细胞通过自体吞噬作用得以在短时间内清除一部分合成激素的细胞器和其中的激素,这可能是分泌类固醇激素的细胞及时有效地调整激素分泌量的一项重要机制,与分泌蛋白质激素细胞的分泌吞噬有着相同的意义。     

烟草合子与二胞原胚在离体培养中的发育

用酶解-研磨法分离烟草与大叶烟草受精后的胚囊,继之以显微解剖分离合子与二胞原胚。将3—5个合子或二胞原胚置于微室的琼脂糖小滴中,以预先培养3—4天、分裂1—2次的烟草、大叶烟草或黄花烟草叶肉原生质体饲养。培养基为KM8p与其它附加成分。在25℃与黑暗下静置培养。培养3—4天,约60%合子完成第一次分裂。多数行不等分裂产生大小两个细胞。12天后形成少数原胚或多细胞团。二胞原胚培养亦分裂为多细胞原胚。研究了合子分离方法、合子发育时期、饲养细胞种类与培养天数等因素对合子离体发育的影响。     

arg-13可能参与鸟氨酸在粗糙脉孢霉线粒体的过膜转运(英文)

arg-13为精氨酸代谢途径里的一个渗露型突变。经研究发展了该突变的严格选择方法。该法省略了基本培养基的氮源而加上相似浓度的鸟氨酸与赖氨酸。此法在严紧山梨糖/葡萄糖条件下能强烈抑制arg-13突变株生长,但在斑点试验条件下允许arg-13突变株生长。由于鸟氨酸是通过线粒体合成和由细胞质至线粒体的过膜转运而积累,我们构建了arg-4,arg-13双突变株,其中arg-4阻断了线粒体鸟氨酸合成。在斑点试验条件下,arg-4,arg-13双突变株能利用鸟氨酸作为唯一氮源与精氨酸合成前体,但受赖氨酸与刀豆氨酸强烈抑制。具正常鸟氨酸转运功能的arg-4单突变株在鸟氨酸基本培养基的生长只受微弱的赖氨酸抑制。已有报道arg-13为嘧啶合成代谢途径里pyr-3(CPSACT~ )突变的部分抑制基因,序列分析表明arg-13编码一线粒体转运酶。本文数据提示arg-13在线粒体鸟氨酸过膜转运过程中起主要作用。arg-13突变株仍携带一定的线粒体鸟氨酸转运功能并受碱性氨基酸赖氨酸、刀豆氨酸抑制,可能为另一线粒体碱性氨基酸转运酶介导。     

家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为

一、用显微外科方法从兔早期胚泡分离来的ICM在所用的体外培养系统中的行为,因ICM的生长状态而不同。呈带状生长的ICM从近端向远处延伸,而细胞的分化则从远端逐渐向近端进行,它具有明显的极性。细胞的分化秩序井然,层次分明。因此呈带状生长的ICM适用于进行细胞分化和细胞谱系的研究。二、呈团块状生长的ICM,没有明显的极性,细胞分化开始于团块的外表面,逐渐向中央进行。细胞分化开始稍晚一些,速度也较慢,这种生长状态的ICM适用于分离胚胎干细胞。三、兔子胚外内胚层从ICM分化来,它经历了二次分化的过程。第一次发生于培养后第三天(相当于交配后第七天),形成第一胚外内胚层-胚外体壁内胚层,它向远处迁移,远离原始外胚层。培养后四天(相当于交配后第八天),形成第二种胚外内胚层-胚外脏壁内胚层,它尾随体壁内胚层向远处迁移,其后缘的部分细胞向原始外胚层附近的滋胚层下面侵润。四、胚外体壁内胚层和脏壁内胚层的细胞是由少数决定了的和离开ICM的细胞分化和增殖而来。五、文中讨论了早期胚胎细胞分化的谱系问题。     

斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术的建立(简报)

随着人类基因组框架图的完成,解读大量基因的功能和表达调控成为亟待解决的问题。因此通过模式生物从个体水平、细胞水平和分子水平研究基因功能及其表达调控日益成为一个重要的研究领域。斑马鱼(Brachydanio rerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于:个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,2—3天即可完成主要器官的建成;可以方便的进行大规模的诱变和突变型筛选等研究。它已成为脊椎动物胚胎发育遗传学和基因功能研究中理想的模式生物。整胚原位杂交技术是     

理化诱变引起的小麦再生株染色体变异

小麦幼胚和愈伤组织经理化诱变后形成的再生株M_1R_1和C_1R_1,具有比R_1株高的染色体变异频率,其染色体数目变化于35—46之间,但无倍数变异。理化诱变处理提高了再生株中含非整倍体、棒状二价体、单价体、等臂环和四价体的细胞频率,其中以1000伦琴γ射线照射未成熟胚处理的再生株染色体变异频率为最高。其次为2 mmol/L叠氮化钠处理愈伤组织的再生株。经过二倍体和单倍体选择,染色体变异大为减少,但仍保有较高频率的单价体。     

核体(Karyoplast,细胞去核产物)合成RNA的能力

近十年来由于细胞松弛素B(Cyto-chalasin B,以下简称CB)引起细胞群体去核的方法的建立和不断完善,为细胞核与质的相互作用关系研究提供了一个新的实验手段。为详尽地了解CB处理细胞所获的核体和胞质体的特性,以便利用其进行核质关系方面的研究,我们利用显微与电镜放射自显影技术对CB处理所获各类核体作了RNA代谢的研究。核体(Karyoplast)是外面包被着细胞质膜并带有不同量胞质的细胞核,核体本身就是研究细胞核与质相互关系的好材料。通过对核体的研究,可从中探讨大分     

兰州北山三种蜥蜴春季食性分析

兰州地区密点麻蜥、丽斑麻蜥和草原沙蜥的春季食物均为动物食物。无论在栖息地重叠地区还是非重叠地区,三种蜥蜴的食物种类在种间均无显著差异（Ｆ＝０．８６１,ｄｆＴ＝２,ｄｆＥ＝３６,Ｐ〉０．０５）。种内不同性别和年龄食性无显著差异。