A型肉毒毒素Hc结构域在大肠杆菌中的高水平表达及免疫原性

对A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的全序列进行优化和人工合成,获得了全长1287bp,编码429aa的Hc基因。以pTIG-Trx为原核表达载体,实现了Hc在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化,该表达水平可占可溶性全菌总蛋白的36%～53%,经一步亲和层析纯化可获得电泳级纯度的目的蛋白,在常规培养条件下,产量达到30mg/L以上。然后,纯化的重组蛋白Hc免疫小鼠后能够诱导产生高滴度特异性的抗体,也能诱导产生特异性的细胞免疫应答反应。小鼠体内A型肉毒毒素中和试验结果表明免疫组小鼠血清中含高滴度的体内中和抗体。结果表明,利用本实验的原核表达系统不仅能够高水平可溶性地表达A型肉毒毒素受体结合区Hc,而且重组Hc具有良好的免疫原性,可以用于制备治疗性抗毒素和作为亚单位候选疫苗用于预防A型肉毒毒素中毒。     

A型肉毒毒素Hc片段B细胞表位预测

应用4种参数和方法对A型肉毒毒素Hc片段进行综合分析,包括亲水性参数、可及性参数、抗原性参数和二级结构预测等方法,预测A型肉毒毒素Hc片段(BoNT/A-Hc)氨基酸序列的B细胞表位,结果显示B细胞表位可能位于其Hc片段残基第37-42、294-300、355-359、400-411等区域内或附近.分析预测结果将有助于确定BoNT/A-Hc的B细胞表位.     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

重组百日咳毒素Sl亚单位的纯化及免疫原性

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOPl0两株大肠杆菌中进行表达,并对表达产物进行了初步纯化。粗制的rSl免疫家兔所得血清,用HP—PT及1B7-PT包被的ELISA测定效价,并做被动免疫保护试验。抗PT的抗体滴度为1：32000。该抗rSl血清在小鼠被动免疫保护试验中,对百日咳杆菌18323毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到100％。证明rSl亚单位具有良好的抗原性和免疫原性,并与天然S1具有相同的抗原表位。     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

肉毒毒素结构及其重组疫苗的相关研究进展

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G).肉毒毒素属神经强毒,是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质.作为重要的生物战剂之一,对肉毒毒素的研究已经相当深入,基本明确了各型肉毒毒素的基因序列、同源性和三维结构及毒素作用的本质和机理.随着国际恐怖活动的日益猖獗,针对肉毒毒素的检测和预防也备受关注,对其疫苗的探索已成为研究的焦点.本扼要介绍了肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的相关研究进展.     

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原, 构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子表达载体。RNA和DNA复制子载体转染BHK21细胞后, 经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测, 结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达; 而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒, 该重组病毒颗粒感染细胞后, 也都能表达Hc抗原。以上结果表明, 基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得, 为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础, 从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。     

重组黄热病毒E蛋白结构域Ⅲ作为亚单位疫苗的抗原性和免疫原性

目的：表达纯化黄热病毒（YFV）囊膜蛋白（E蛋白）结构域Ⅲ,研究其作为亚单位疫苗预防YFV、日本脑炎病毒（JEV）感染的可能。方法：扩增YFVE蛋白结构域Ⅲ（YFDⅢ）的cDNA片段333bp,将其连接到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-YFDⅢ,转化感受态大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达重组YFDⅢ;用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔和BALB/c鼠,检测相关抗体滴度。结果：在大肠杆菌中可溶性表达了YFDⅢ融合蛋白,表达量约占菌体蛋白的50%;Western印迹及ELISA分析表明,纯化的YFDⅢ具有良好的抗原性和免疫原性;利用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔,获得了高达1∶4×105滴度的抗YFV抗体和1∶2×104滴度的抗JEV抗体;利用纯化的YFDⅢ免疫BALB/c鼠,获得了1∶7×104滴度的抗YFV抗体和1∶2×103滴度的抗JEV抗体。结论：重组YFDⅢ有较好的免疫原性,具有开发成亚单位疫苗的潜能。     

肉毒梭菌D型毒素复合物的完整的亚单位结构

肉毒毒素复合物(TC)是由神经毒素(NT)与附属的非毒蛋白即非毒非血凝素成分(NTNHA)与血凝索(HA)所组成。在动物胃肠道,游离的NT是从TC解离来的。NT在消化液的蛋白酶解与酸性作用下,降解成小肽与氨基酸。NTNHA蛋白与一些HA对于蛋白酶解具有抵抗性,推测NTNHA在动物消化道保护NT。已有提议HA成分识别小肠微绒毛的糖链,因此HA可能具有加速肉毒NT经过小肠壁的吸收作用。     

重组百日咳毒素S1亚单位的纯化及免疫原性

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOP10两株大肠杆菌中进行表达,并对表达产物进行了初步纯化.粗制的rS1免疫家兔所得血清,用HP-PT及1B7-PT包被的ELISA测定效价,并做被动免疫保护试验.抗PT的抗体滴度为1:32 000.该抗rS1血清在小鼠被动免疫保护试验中,对百日咳杆菌18323毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到100%.证明rS1亚单位具有良好的抗原性和免疫原性,并与天然S1具有相同的抗原表位.     

霍乱毒素B亚单位在疫苗研究中的应用

CTB不同于CT,没有毒性,在体内和体外CTB具有强的免疫调节活性。越来越多的证据表明CTB在疫苗研究中发挥重要作用。深入理解CTB的免疫调节机制及其在疫苗研究中的应用,有助于设计新疫苗和改良疫苗。因此,将对CTB在疫苗研究中的应用进展进行综述。     

F型肉毒毒素的制备及类毒素免疫原性初探

将F型肉毒梭菌经适宜条件产毒培养后,以硫酸铵盐析和酸沉两种不同工艺制备的F型肉毒毒素,用分段脱毒法脱毒制备类毒素,分别免疫豚鼠、马匹后测定免疫血清抗体效价。结果显示,两种工艺制备的毒素其类毒素都具有较好的免疫原性。     

鼠疫重组亚单位疫苗

传统的鼠疫疫苗有两种类型：①灭活疫苗。1896年Haffkine首先研制并应用。美国一直采用鼠疫强毒菌株(195/P)生产USP死疫苗用于军队和高危人群免疫接种;②活疫苗。1926年Girard和Robic在马达加斯加分离选育出EV减毒株,1932年开始在该岛进行疫区人群免疫观察,随后在一些国家高危人群接种。     

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。     

IEF纯化重组A型肉毒毒素保护性抗原

在大肠杆菌中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468),是以包涵体形式存在,将表达菌株发酵后,裂解菌体,制备包涵体,溶解后的包涵体溶液经样品处理,通过等地电聚焦制备型电泳纯化,纯化的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468)纯度高于90%,产量及回收率高,纯化的重组表达产物酶联检测具有结合活性,这为下一步A型肉毒毒素抗毒素的研制打下基础。     

烟草生产霍乱毒素B亚单位疫苗的免疫分析

用纯化的ＣＴＢ后腿肌肉注射免疫小鼠,每次１２．５μｇ,每隔１４天加强一次,共注射三次,末次免疫后两周收集血清,免疫小鼠诱导产生了特异性抗ＣＴＢ抗体。在ＣＨＯ细胞中,免疫小鼠血清能够中和ＣＴ的细胞病变效应;小鼠肠结扎实验表明,抗ＣＴＢ血清能够抑制ＣＴ结合细胞表面受体ＧＭ１神经节苷脂。这表明转基因烟草产ＣＴＢ在小鼠中能够产生抗细菌毒素的保护免疫力。     

C型肉毒毒素与C型肉毒中毒

本文介绍了Ｃ型肉毒毒素的纯化、生物学特性,并从流行病学角度对动物Ｃ型肉毒中毒的发生、中毒机理及临床表现、诊断、治疗及预防等进行了概述。对近年来Ｃ型肉毒毒素在分子水平、作用机理等方面的研究进展做了简要介绍。     

重组亚单位疫苗的表达系统

传统疫苗多是通过系列传代或用化学或物理的方法使某些成分失活后制成的,尽管很有效,却存在着毒力逆转引发疾病的危险。重组亚单位疫苗相对安全性高,具有较大的发展前景。重组亚单位疫苗抗原需具有一定的对于维持疫苗效率所必需的空间构型和翻译后修饰,它的抗原性受到所选用表达系统的影响。因此,在制备重组亚单位疫苗时就需对表达系统进行谨慎选择。本文就重组亚单位疫苗各种生产宿主的特性和适用范围作一简介。