肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白的表达及其体外生物活性研究

利用PCR技术克隆截短型HPV58 L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac-Htb,通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组,分离重组的Bacmid DNA, 并转染Sf-9昆虫细胞,收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测可见在大约58Kda处出现一新生蛋白条带,Western blot 证实为HPV58L1蛋白。用ProBondTM纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV58L1蛋白,纯化后的截短型HPV58L1蛋白在体外可自组装VLP,并具有介导小鼠红细胞凝集的生物学活性。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（hTNFR1）基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1,电转到Escherichia coli BL21（DE3）表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明,在hTNFR1的N端融合NusA标签后,hTNFR1的可溶性有一定提高;在NusA-hTNFR1基础上,过表达了7种分子伴侣,筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,可溶性表达量约占总量的90％;对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签,结合Western blot分析鉴定,获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG( )的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性、定量分析有助于该疾病     

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1-VLP两种抗原在检测宫颈癌抗16 L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长1535bp的HPV16L1基因片段,克隆至pUC18-T载体中,进行DNA测序鉴定.然后,将HPV16L1基因克隆至pGEX-2T表达载体中,并诱导表达HPV16L1融合蛋白,分子量为83kD,能被HPV16L1单克隆抗体所识别.经GST柱层析法纯化后,与重组腺病毒表达的HPV16L1-VLP分别经酶联免疫吸附(ELISA)法检测12份宫颈癌患者和35份献血员血清.12例宫颈癌血清标本中,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为7例(占 58.3%);抗HPV16L1-VLP的抗体阳性率为8例(占 66.7%).经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体 IgG(+)的 7份患者血清,利用HPV16L1-VLP试剂盒检测均阳性;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体 IgG(-)的5 份患者血清,利用HPV16L1-VLP试剂盒检测有1份阳性.两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异(P>0.05).本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1-VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响.利用重组抗原HPV16 L1对宫颈癌的抗体进行定性、定量分析有助于该疾病的诊断.     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。     

原核表达系统制备HPV58L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体

目的:采用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus type 58,HPV58)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。方法:合成法获得HPV58 L1大肠杆菌密码子优化基因,构建HPV58 L1重组原核表达质粒mpET22b/HPV58 L1,检测其在BL21(DE3)中表达水平,饱和硫酸铵沉淀加阳离子交换层析法纯化蛋白后进行动态光散射(dynamic light scatter,DLS)分析。小鼠免疫后,检测免疫血清针对HPV58假病毒的中和抗体水平。结果:HPV58 L1蛋白在BL21(DE3)细胞中大部分以可溶形式表达,纯化获得的HPV58 L1蛋白可组装成水动力学直径约为74 nm的VLP。0.5μg的HPV58 L1 VLP可诱发小鼠产生高滴度的HPV58特异性中和抗体,可维持至少20周。结论:原核表达系统制备的HPV58 L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体,可用于成本低的HPV58疫苗的研究。     

姜老师信箱

<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第15期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,想请教您有关凝血酶酶切的问题。我用pGEX-4T-1载体可溶性表达了HPV18 L1蛋白。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在,在进行GST纯化前,先后加入5mmol/L ATP、10mmol/L MgCl2、150mmol/L KCl、20%甘油和3.5mol/L尿素去除伴侣,13 000r/min、4℃离心75min。将菌体上清直接进行GST纯化,用含有3mmol/L DTT、0.2mol/L Nacl、1mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris pH 8.0溶液洗去杂     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

分子伴侣对白喉毒素无毒突变体CRM197重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白 (Cross-reacting material 197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达。将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析。结果发现：利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20 ℃条件下诱导16 h时,目的蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好。因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM197一抗发生特异性结合,证实CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础。     

小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的：表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法：生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。 结果：在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5-C-3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。 结论：实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。     

幽门螺杆菌Lpp20融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

目的:利用GST融合基因表达系统表达Lpp20-GST融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签.方法:IPTG诱导重组质粒Lpp20/pGEX-4T -1在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,发现Lpp20-GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达.采用GST蛋白纯化系统对其纯化,得到Lpp20- GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western Blot鉴定.结果:高效表达出Lpp20-GST融合蛋白的相对分子质量约4.5kDa,凝血酶成功切除了GST标签,Western Blot证实Lpp20蛋白能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别.结论:成功表达和纯化了重组Lpp20蛋白,为深入研究Lpp20的功能奠定了基础.     

游仆虫中心蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体制备

中心蛋白是一种在微管组织中心的复制和分离中起着重要作用的蛋白质。为了进一步进行中心蛋白结构和功能的研究 ,我们克隆了单细胞真核生物游仆虫中心蛋白基因并构建了重组表达质粒pGEX 6P EoCen ,其在大肠杆菌BL2 1中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达 ,融合蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的 32 6 %。GST抗体进行Westernblotting检测结果为阳性。经GST亲和层析和superdex 75凝胶层析后得到 90 %以上电泳纯的蛋白。用纯化后的蛋白免疫大鼠产生抗血清 ,经ELISA检测抗体效价达 1∶2 5 6 0     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：利用大肠杆菌DH5α表达GST—Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法：利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达。经谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体。结果：ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1∶40 000。免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析。结论：制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体,经实验验证获得的抗体能够满足针对Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具。