2型猪链球菌MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为SSU0562基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选SSU0562基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S.suis2中SSU0562基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中SSU0562基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因SSU0562基因的缺失而发生显著性改变,表明SSU0562基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。     

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析

【目的】 通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。     

猪链球菌cAMP结合蛋白基因敲除株的构建及生物学特性

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 c AMP结合蛋白(CRP)编码基因敲除突变株及基因回复互补株,并探究CRP基因的缺失对细菌生物学特性及毒力的影响。方法:构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr)、两侧为CRP编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选CRP编码基因敲除突变株ΔCRP;构建CRP编码基因的互补质粒,通过电转化敲除株ΔCRP,筛选CRP的基因回复互补株CΔCRP;比较分析突变株、野生株和回复互补株的基本生物学特征的差异,并以小鼠作为动物感染模型对突变株、互补株及野生株的毒力进行评估分析。结果:应用组合PCR和基因测序分析,证实构建了CRP的突变株ΔCRP,并筛选出CRP的回复互补株CΔCRP;逆转录PCR证实在突变株ΔCRP中CRP在转录水平缺失,而在回复互补株CΔCRP中其转录回复;在丰富营养情况下,突变株ΔCRP与野生株的溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力均无显著性差异,但突变株的成链能力减弱。结论:CRP编码基因的缺失并未显著改变野毒株05ZYH33的基本生物学特性和毒力,提示CRP可能不是猪链球菌的关键毒力决定因子,其参与碳源代谢等功能有待进一步研究。     

猪链球菌2型荚膜唾液酸对细菌毒力和宿主炎症反应的影响

【目的】阐明猪链球菌2型荚膜唾液酸是否影响细菌毒力以及宿主对其炎症反应应答,为研究猪链球菌2型的致病机制奠定基础。【方法】比较实验菌株对BLAB/c小鼠模型的致病性;通过涂板计数的方法检测实验菌株在小鼠体内的分布;观察小鼠脑组织病理改变,分析实验菌株感染小鼠后中枢神经系统的病变差异;从小鼠体外全血细胞水平,运用ELISA法检测实验菌株感染后细胞炎性因子的分泌水平。【结果】荚膜唾液酸合成基因neuB缺失突变株ΔneuB相比野生株05ZYH33株,对小鼠毒力显著降低,回复突变株cΔneuB毒力回复至野生株水平;野生株和突变株在血液及脑组织中分布具有显著差异,均可致BLAB/c小鼠脑组织不同程度的损伤;与野生株组相比较,细菌/细胞相互作用不同时间点后,突变株组体外刺激小鼠全血细胞分泌MCP-1、IL-6的水平显著提高;【结论】荚膜唾液酸影响细菌的毒力及宿主细胞对其的炎症反应应答,它是猪链球菌2型穿透血脑屏障导致脑膜炎的重要毒力因子。     

猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD4与毒力相关性分析

摘要:【目的】构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33毒力岛89 K上的Ⅳ型分泌系统组分VirD4敲除突变株,初步分析其活性和毒力,为进一步研究猪链球菌2 型在逃避宿主天然免疫杀伤中的作用提供基础。【方法】以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增VirD4基因上下游同源臂,以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR技术搭建上述3个片段并连接至温敏载体pSET4s,构建基因敲除载体pSET4s∷VirD4;通过同源重组构建基因敲除突变株ΔVirD4;通过体外全血杀伤实验、CD1小鼠竞争感染及攻毒实验 对突变株和野生株的毒力进行比较分析。【结果】获得了基因敲除突变株ΔVirD4,通过对比发现其毒力与野生株相比有所降低。【结论】猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD 与其毒力相关,并在早期抵抗天然免疫细胞杀伤中发挥一定作用。     

2型猪链球菌Fbps基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:敲除2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33中的Fbps基因,研究该基因敲除对菌株生物活性及毒力的影响,为深入探讨猪链球菌致病机制提供实验基础。方法:从05ZYH33基因组中扩增Fbps基因上、下游同源臂,从pSET1质粒中扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR的方法将3个片段整合后连接到温敏自杀载体pSET4s上,电转入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经抗性筛选获得敲除株05ZYH33ΔFBPS,分析敲除株的生物学性状,以CD1小鼠作为体外感染模型对突变株和野生株进行毒力比较。结果:PCR分析和测序结果均显示Fbps基因敲除成功,动物实验结果显示Fbps基因敲除后05ZYH33的毒力有所下降。结论:与野生株相比,突变株对小鼠的毒力有所降低。     

脑膜炎大肠杆菌K1株ppk1基因致病机制初探

【目的】构建脑膜炎大肠杆菌K1(Escherichia coli,E.coli K1)株E44的聚磷酸盐激酶1(Polyphosphate kinase 1,PPK1)基因敲除株,并对其生物学功能进行初步研究,为明确ppk1基因在E.coli K1株致脑膜炎机制中的作用奠定基础。【方法】利用自杀质粒pCVD442及基因同源重组技术敲除E.coli K1株E44中的ppk1基因,构建ppk1缺失突变株Δppk1;体外比较野生株和突变株在低营养及氧化压力情况下的生存能力;考察二者对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)的黏附能力;通过测定乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放活性,比较野生株和突变株对HBMEC的损伤效应。【结果】PCR及序列分析证实,突变株缺失全长ppk1基因。与野生株E44相比,ppk1突变株Δppk1在低营养环境中和氧化刺激条件下的生存能力明显降低。相对于E44,Δppk1对HBMEC的黏附能力减弱。与HBMEC孵育后,突变株孵育组HBMEC的LDH释放活性明显低于野生株孵育组。【结论】ppk1对E.coli K1株E44在低营养环境中的生存、抵抗氧化压力,以及黏附HBMEC和对细胞的毒性损伤有重要作用。     

猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。     

大肠杆菌yijP侵袭蛋白诱导人脑微血管内皮细胞凋亡

为研究大肠杆菌的脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的功能,将yijP基因（1．04kb）克隆到pQE30表达载体,构建表达产物为N末端带有6个组氨酸（His）序列的yijP汇合蛋白,以M15（pREP4）为受体菌,大量表达（His）6-yijP汇合蛋白,利用Ni—NTA亲和层析纯化汇合蛋白,将经透析法复性的一定浓度的（His）6-yijP蛋白加入到体外培养的人脑微血管内皮细胞中,结果显示yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞有较强的细胞毒作用：在相差显微镜下可观察到细胞皱缩、胞膜呈泡状膨出,随着时间延长细胞逐渐脱落;荧光显微镜下可见细胞核呈现为致密团块状或圆形浓染颗粒状,呈凋亡样改变：DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带;流式细胞仪显示在正常二倍体峰之前出现一个亚二倍体峰;Western印迹可检测到caspase-3的活性片段。这些现象均出现在yijP蛋白作用于人脑微血管内皮细胞的16h之后,提示在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,yijP蛋白可能起到诱导脑微血管内皮细胞迟发性凋亡的毒素作用。     

葡萄球菌肠毒素B诱导脐静脉内皮细胞凋亡机制的探讨

目的探讨金黄色葡萄球菌(金葡菌)肠毒素B诱导脐静脉内皮细胞凋亡的机制。方法将不同浓度金葡菌肠毒素B感染脐静脉内皮细胞8 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率,同时用比色法检测TNF-α、caspase-3及caspase-8的产生量,并检测加入TNF-α抗体、caspase-3和caspase-8抑制剂后的细胞凋亡率。结果不同浓度肠毒素B作用脐静脉内皮细胞8 h后均可诱导细胞凋亡,且TNF-α、caspase-3和caspase-8的产生量均高于对照组(P0.01);而加入TNF-α抗体、caspase-3和caspase-8抑制剂后凋亡率明显降低。结论金葡菌肠毒素B可以诱导脐静脉内皮细胞凋亡,其凋亡机制可能是通过TNF-α介导的caspase-8及caspase-3激活的外源性死亡因子受体途径。     

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌.为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长.利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆茼的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少.利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低.这些结果提示,在大肠杆茼K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制.     

肠球菌溶血及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞表达TNF-α的影响

【目的】探讨肠球菌溶血菌株及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞RAW264．7表达TNF-α的影响。【方法】用多粘菌素B抑制排除内毒素污染对实验的影响。肠球菌溶血菌株、非溶血菌株各11株,以菌／细胞比30：1感染RAW264．7细胞1h,加入200gg／mL氨苄青霉素继续培养24h,分别于感染后3、6、9、24h,用ELISA方法检测不同观测点细胞培养液中肿瘤坏死因子TNF-α的含量,并用逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）比较肠球菌溶血、非溶血菌株感染6h后TNF-α RNA表达的差异。【结果】未感染的RAW264．7细胞培养液中检测不到TNF-α。肠球菌溶血株感染组细胞培养上清液中各观测点的TNF-α的平均含量（pg／mL）均比非溶血株性组高。经t检验,P〈0．01,差别有显著性。RT-PCR法检测其mRNA的表达也有相同结果：TNF-α RNA在肠球菌溶血株感染细胞中的相对表达量比非溶血株感染的细胞高,经t检验,P〈0．05,差别有统计学意义。【结论】肠球菌溶血株比非溶血株更能促进小鼠巨噬细胞RAW264．7产生TNF-α炎症因子。     

缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:从2周龄的SD大鼠中提取脑微血管内皮细胞。体外模拟脑缺氧微环境,将体外培养的脑微血管内皮细胞分别置于常氧(21%O_2)和低氧环境(1%O_2)下处理6、12和24小时,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观测不同时间点细胞增殖能力的变化;用AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术观察不同时间点细胞凋亡情况;Real time-PCR和Western blot法检测细胞中(Hypoxia-inducible factor-1α) HIF-1αm RNA和蛋白的表达。进一步使用HIF-1αsi RNA靶向沉默HIF-1α基因,再检测低氧环境下HIF-1αm RNA和蛋白表达、细胞增殖以及凋亡水平的变化。结果:随着低氧处理时间的延长,大鼠脑微血管内皮细胞的增殖能力被显著抑制,同时凋亡水平显著增加,HIF-1αm RNA和蛋白表达水平显著升高。使用HIF-1αsi RNA特异性阻断HIF-1α表达后,低氧环境下HIF-1αm RNA和蛋白表达明显降低,同时细胞活性增加,细胞凋亡率显著下降。结论:缺氧微环境能够通过上调HIF-1α的表达抑制大鼠脑微血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

低氧条件下沉默HIF-1α与TNF-α、IL-6的相关性研究及人真皮微血管内皮细胞生物学行为的变化

该文探讨了低氧条件下沉默缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的相关性及人真皮微血管内皮细胞生物学行为的变化。采用三气培养箱培养人真皮微血管内皮细胞,根据时间和氧浓度分组,确定最适培养时间及缺氧浓度。同时,构建靶向HIF-1α的腺病毒并感染人真皮微血管内皮细胞,分为对照组、空载组和沉默组。应用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质水平。Transwell检测细胞迁移能力,流式细胞技术观察细胞凋亡及细胞周期变化。结果显示,缺氧条件下,HIF-1α、TNF-α和IL-6的表达随缺氧时间延长而增加,随氧浓度降低而增加。与对照组相比,沉默组的细胞迁移能力(P0.01)及周期(P0.01)均明显抑制,细胞凋亡明显增加(P0.01)。与对照组相比,沉默组TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质水平均减少(P0.01)。由此可见,缺氧条件下,HIF-1α、TNF-α和IL-6的表达呈时间依赖性和氧浓度递减依赖性。人真皮微血管内皮细胞HIF-1α的表达与炎性因子TNF-α、IL-6具有明显的正相关。沉默HIF-1α后,能明显抑制细胞增殖,抑制细胞迁移,促进细胞凋亡。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株外膜蛋白H的致病作用

目的:探讨禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)的致病作用。方法:用大肠杆菌表达系统表达强毒株C48-3的重组蛋白OmpH,亲和层析法纯化N端带有6个组氨酸标签的重组OmpH,通过皮下注射兔制备抗OmpH抗血清,用生物学功能实验比较野生株C48-3、突变株ΔompH和互补株C48-3C的粘附能力、血清抵抗性和抗吞噬作用。结果:与野生株和互补株相比,突变株对CEF细胞的粘附能力显著降低,而抗OmpH抗体显著抑制野生株和互补株对CEF细胞的粘附,但该抗血清不影响突变株的粘附能力。野生株和互补株在鸡血清中的存活率显著高于突变株,但灭活鸡血清处理不影响它们的存活率。小鼠腹腔巨噬细胞对突变株的吞噬能力显著高于野生株和互补株,而抗OmpH抗体增强巨噬细胞对野生株和互补株的吞噬能力,但该抗体不影响巨噬细胞对突变株的吞噬能力。结论:OmpH是禽巴氏杆菌的致病因子,它在该菌对宿主的感染与致病过程中发挥重要的作用。     

荚膜唾液酸对猪链球菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路影响的研究

[目的]探索猪链球菌2型感染后单核/巨噬细胞启动信号转导通路机制,探讨荚膜唾液酸对细菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的影响.[方法]以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光和ELISA法分别检测猪链球菌2型野毒株、唾液酸缺失突变株、唾液酸回复突变株感染后不同时间点巨噬细胞TLR2 mRNA转录水平、AKT磷酸化水平、NF-κB激活程度以及前炎症因子TNF-α分泌水平;再分别用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂预处理巨噬细胞,检测上述分子的表达水平.[结果]唾液酸缺失株可选择性的活化信号转导通路途径.RT-PCR结果表明,缺失株TLR2 mRNA表达水平自1h开始升高,1.5 h达高峰后有所下降;Westernblotting显示,缺失株TLR2蛋白表达水平7h达高峰,9h下降;p-AKT水平1.5-5 h持续稳定在高峰水平,7h后开始下降;免疫荧光可见15 min NF-κB激活-核转运程度较高;ELISA结果显示,10h之后TNF-α的水平显著高于野生株和回复株.使用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂,三菌株通路活化程度均明显受抑制.[结论]荚膜唾液酸可抑制宿主免疫细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的激活,藉此参与细菌逃避宿主的免疫防御作用.     

胶质细胞源性神经营养因子(ΔN39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究

为了研究胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) 在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(ΔN39)活性片段. 将HIV-1 Tat 蛋白转导区 (protein transduction domain,PTD) 的9个碱性氨基酸⁴⁹RKKRRQRRR⁵⁷模拟物9个精氨酸(R9)与GDNF(ΔN39)活性片段融合表达,获得纯度达95%以上的GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白. 将GDNF、GDNF(ΔN39)、GDNF(ΔN39)-R9分别加入原代培养的中脑多巴胺能神经元和转染GDNF受体GFRα1和Ret的PC12细胞中,观察它们的神经营养活性和毒性. 运用脑微血管内皮细胞株B-Endo 3,观察GDNF(ΔN39)-R9蛋白穿越血管内皮细胞膜的功能;运用脑血管内皮细胞和Matrigel铺板模拟血脑屏障,Transwell法检测Tat-GDNF(ΔN39)蛋白穿越脑血管内皮细胞和外周胶质膜的能力. 结果显示：GDNF(ΔN39)-R9蛋白具有类似GDNF的神经营养活性,促进原代培养的中脑多巴胺能神经元和稳定表达GFRα1和Ret受体的PC12-GFRα1-Ret细胞株的存活,没有显示毒性,并且能很好地穿过脑微血管内皮细胞层和模拟的血脑屏障.     

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌．为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长．利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆菌的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少．利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低．这些结果提示,在大肠杆菌K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制．     

prfA基因缺失影响单增李斯特菌诱导细胞凋亡的能力

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)入侵宿主细胞并带来危害,包含3个关键性环节,即宿主细胞的黏附和侵袭、细胞内增殖和运动、细胞间传播。每个环节的实现均需要不同毒力因子的调控,不同血清型Lm毒力的强弱取决于其毒力因子的活性,prfA基因作为Lm毒力的调控基因起到至关重要的作用。本研究使用单增李斯特菌野生株EGDe及其prfA基因缺失株EGDe-ΔprfA,以人结肠癌腺细胞Caco-2和人肝癌上皮细胞HepG2为研究对象,通过细胞侵袭实验和诱导凋亡能力探究prfA基因缺失对EGDe毒力的影响。溶血实验结果表明prfA基因的缺失并不会明显改变EGDe的溶血能力;侵袭实验表明突变株与EGDe野生株相比对Caco-2细胞和HepG2细胞侵袭能力分别下降了40%和30%;EGDe-ΔprfA处理组与EGDe处理组相比较,Caco-2细胞和HepG2细胞平均凋亡比例分别下降了35.8%和43.7%,说明prfA基因敲除后会降低细胞凋亡。本研究初步证实了prfA基因对EGDe毒力的调控作用,prfA基因缺失降低EGDe侵袭过程中的细胞凋亡,这对于了解EGDe的致病机理及进行相关研究有重要作用。     

自噬抑制肿瘤坏死因子α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞发生凋亡

目的:探讨TNF-α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)发生凋亡和自噬的作用,以及自噬对细胞凋亡的调控作用。方法:利用流式细胞术检测无血清培养hfPMSCs中CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达;用终浓度20μg/L的TNF-α处理hfPMSCs 24h,以未处理细胞作为对照组。Annexin V/PI双染色检测TNF-α对hfPMSCs凋亡程度的影响;分别提取各组总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察胞内点状聚集形成的情况;利用Atg5干扰慢病毒(si-Atg5)及阴性对照慢病毒(si-NC)感染hfPMSCs,Annexin V/PI双染色检测TNF-α对慢病毒感染后hfPMSCs凋亡程度的影响。结果:所培养细胞具有典型的MSCs形态,呈CD73~+CD90~+CD105~+/CD14~-CD34~-CD45~-细胞; Annexin V/PI染色结果显示,TNF-α作用24 h后,hfPMSCs凋亡数和凋亡率均高于对照组(P 0. 05);Western blot检测自噬标志蛋白表达结果表明,TNF-α可增加LC3Ⅱ的表达(P 0. 05);荧光共聚焦显微境观察到TNF-α可显著提高细胞中的点状聚集。利用si-Atg5感染细胞,抑制hfPMSCs自噬的发生,与对照慢病毒si-NC感染细胞比较,可显著促进TNF-α诱导hfPMSCs凋亡的发生(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导的自噬抑制人胎盘胎儿来源MSCs凋亡的发生,具有一定的保护性作用。