应用ELISPOT方法筛选确定HIV-1B'/C亚型疫苗六种抗原的H-2d限制的T细胞表位

为了筛选和确定用于检测表达HIV-1 B’/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、polr、evt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位,本研究使用表达上述6种抗原的复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过矩阵设计将HIV-1 B(C)亚型6种相应抗原全序列肽库分别混合成肽池,使用肽池对免疫小鼠进行IFN-γELISPOT检测,根据检测结果确定肽库中特异反应的优势表位肽。结果显示:筛选到七条针对Gag的特异表位肽,其中有5条与文献报道相同,另2条为新表位肽;筛选到3条针对Pol蛋白特异表位肽,其中一条为新表位肽;筛选到2条针对gp160特异表位肽,其中一条为新表位肽;在Nef肽库中筛选到一条新的表位肽;从Tat肽库中筛选到3条表位肽,这三条肽在肽库中是连续的序列,都包含(或部分包含)网上公布的表位序列;在Rev肽库中没有筛选到能够产生阳性反应的特异性表位肽。本研究使用IFN-γELISPOT方法筛选和确定了可用于检测表达HIV-1 B’/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、pol、revt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位。     

金黄色葡萄球菌ClfA蛋白Th表位鉴定及其免疫原性分析

【目的】ClfA蛋白是金黄色葡萄球菌粘附于宿主细胞的最主要粘附因子之一,筛选鉴定ClfA蛋白的Th表位,研制基于表位的联合疫苗将成为该菌疫苗新的发展方向。【方法】本研究采用生物信息学软件预测ClfA可能的H-2d限制性Th表位,并以CD4+T淋巴细胞增殖实验及流式细胞分析进行筛选和鉴定。【结果】获得BALB/c小鼠H-2d限制性Th1表位(C335)和Th2表位(C214,C286和C436)。【结论】筛选出优势性Th细胞表位,并对表位的免疫学特性进行实验免疫研究,为最终研制保护作用强、安全性高的新型疫苗奠定基础。     

埃博拉病毒包膜糖蛋白研究进展

埃博拉病毒可引起人类高致命性流行性出血热暴发,至今没有预防和治疗的疫苗和药物。作为埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白,包膜糖蛋白是一种多功能蛋白质,在病毒的吸附和穿入宿主细胞、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用;同时包膜糖蛋白是保护性免疫的主要目标,是诱导产生中和抗体的最理想抗原。本文就近五年埃博拉病毒包膜糖蛋白的基因结构、致病机制和免疫原性方面的研究进展做简要回顾。     

以副流感病毒为载体的三价埃博拉病毒疫苗诱导的抗体介导的保护机制

<正>埃博拉病毒扎伊尔(Ebolaviruses Zaire,EBOV)、本迪布焦(Bundibugyo,BDBV)和苏丹(Sudan,EBOV)毒株造成人类疾病,病死率高。使用单一包膜糖蛋白(Glycoprotein ,GP)的实验性单价疫苗都不能提供抵御异源埃博拉病毒的保护。以副流感病毒为载体的三价埃博拉病毒疫苗具有无针给药和诱导呼吸道黏膜应答等优点。采取多种途径来诱导针对三种埃博拉病毒的广泛保护。虽然以糖蛋白(GP)共有序列为基础的抗原     

戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗H-2d限制性Th表位的筛选

戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原HEV 239能形成类病毒颗粒,具备演变成多价疫苗的载体的潜力,此文旨在筛选、鉴定其内包含的H-2d限制性Th表位。以50μg HEV 239蛋白与完全弗式佐剂混合后皮下免疫BALB/c鼠,以覆盖HEV 239蛋白全长的15氨基酸肽库体外刺激其脾细胞,用IFN--γELISPOT方法检测其细胞免疫应答,并通过磁珠剔除脾细胞中CD4 T细胞或CD8 T细胞以分析筛选得到的T细胞表位的特性。结果显示:HEV 239中包含优势的T细胞表位P34(HEV PORF2 AA533~AA547,HSKTF FVLPL RGKLS)及数个较弱的T细胞表位,P34对HEV 239免疫的BALB/c鼠脾细胞的刺激效果与HEV 239蛋白相当,剔除实验表明该表位为CD4 T细胞表位,即Th表位。     

激光佐剂辅助的肽疫苗促进皮肤树突细胞的转移并加强抵御疱疹病毒感染及疾病的保护性CD8+ TEM以及TRM细胞应答

针对诸如单纯疱疹病毒2(HSV-2)这类分布广泛并可感染全球大部分人口的病毒类病原体,人们一直迫切地需要无化学及生物成分的安全佐剂以加强疫苗的免疫原性。在此研究中,研究者考察了在生殖器疱疹B6小鼠模型中激光佐剂辅助肽(LAP)疫苗的安全性、免疫原性和保护性效力。LAP疫苗及其无激光肽(LFP)疫苗类似物均含有与各种糖蛋白D CD4^+辅助T细胞表位(HSV-gD 49-89 )共价连接的免疫显性HSV-2糖蛋白B CD8^+T细胞表位(HSV-gB 498-505)。在用LAP进行皮内投递之前,下部被剃的B6或CD11c/eYFP转基因小鼠首先接受5%咪喹莫特乳膏的局部处理,然后将其暴露于采用FDA认可的非烧蚀二极管的激光中持续60秒。     

埃博拉病毒截短型糖蛋白GPdmucin的表达与纯化

目的:确定黏蛋白区缺失的埃博拉病毒包膜糖蛋白(GPdmucin)的最佳表达系统,并获得纯化的GPdmucin。方法:从埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)全长基因上扩增GPdmucin序列,构建至pET32a、pFast Bac1和pcDNA3.4三种不同表达系统的质粒中,分别在原核、昆虫和哺乳动物表达系统中进行表达,并用特异抗体鉴定表达情况。结果:原核系统表达的GPdmucin不稳定,活性差;在昆虫表达系统中,GPdmucin在细胞内以不溶形式表达;利用Expi293瞬时蛋白表达系统,GPdmucin在哺乳动物细胞中可溶性表达,Ni柱亲和层析获得的目的蛋白纯度达90%以上,且与特异抗体具有很好的结合活性。结论:获得哺乳动物细胞表达系统表达的GPdmucin蛋白,将用于GPcl的制备、GP抗体筛选、疫苗效果评价及病毒致病机理的研究。     

用人MHC转基因小鼠模型鉴定高致病禽流感病毒核蛋白CTL表位

目的:筛选高致病禽流感病毒核蛋白(NP)中可用于高致病禽流感病毒感染检测或疫苗设计的CTL表位,为评价疫苗接种效果和开发新型疫苗奠定基础。方法:根据NCBI公布的NP的核苷酸序列设计特异性引物,以2006年深圳株高致病禽流感H5N1病人分离的病毒cDNA为模板扩增NP全长基因(1500 bp)并测序。通过生物信息学方法,预测NP氨基酸序列中潜在的HLA-A觹0201限制性表位。构建重组pJW4303-NP核酸疫苗并肌肉免疫HLA-A2/DP4转基因小鼠,利用ELISPOT法筛选特异性CTL表位。结果:克隆了2006年深圳株高致病禽流感NP基因,构建的重组pJW4303-NP核酸疫苗能在体外COS-7细胞中表达,免疫小鼠后能引起小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫。结论:生物信息学和转基因小鼠模型筛选相结合的方法,能用于高致病性禽流感核蛋白CTL表位的筛选。     

腺病毒载体疫苗对埃博拉感染的非人灵长类提供暴露后保护

正埃博拉病毒(EBOV)在其感染的人群中引起高达90%的致死性疾病。疫苗中,只有疱疹性口炎病毒平台已经成功地在非人灵长类动物中提供了暴露后的保护。在这里,作者表明,人类腺病毒5型(Ad5)作为载体的佐剂疫苗(Ad5-扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白)在埃博拉病毒攻击后30 min和24 h进     

表达埃博拉病毒Makona突变株糖蛋白的腺病毒载体疫苗在豚鼠和非人灵长类动物体内有效

<正>2014~2016年在西非爆发的埃博拉疫情已导致超过11000人死亡,目前还没有批准使用的埃博拉疫苗。以往研究结果显示,表达埃博拉病毒糖蛋白的重组病毒载体疫苗可以保护非人灵长类动物抵抗致死埃博拉病毒攻毒。然而,这些疫苗表达的糖蛋白来源于在中非流行的埃博拉病毒突变株,与在西非爆发的Makona突变株在氨基酸序列上的同源性为97.3%。本研究中,我们证明了免疫Ad5-Mak GP的豚鼠可产生强烈的体液免疫反应;疫苗完全保护了埃博拉     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.     

表达HCV包膜蛋白的两种重组腺相关病毒疫苗的制备及免疫原性分析

重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。     

人类疱疹病毒7型糖蛋白gB、gH、gL、gO介导细胞融合

人类疱疹病毒 7 型(HHV-7)的感染依赖于包膜糖蛋白在病毒生命周期的多个阶段发挥功能. 这些蛋白质可以介导病毒吸附,病毒包膜和宿主细胞膜融合以及病毒在细胞间的接触传播. 将表达 HHV-7 糖蛋白的 293T 细胞与 HHV-7 易感的SupT1 细胞共培养,检测虫荧光素酶报告基因的表达,以鉴定介导膜融合的 HHV-7 糖蛋白. 研究发现,HHV-7 糖蛋白 gB、gH、gL、gO 能介导 293T 细胞与 SupT1 细胞的融合,且融合可被抗 CD4 单抗所抑制. 结果表明,糖蛋白 gB、gH、gL、gO对于 HHV-7 引发的膜融合是必需的,其中某个蛋白质或所形成的蛋白质复合物可能是 CD4 的配体.     

戊肝病毒Th表位肽免疫可增强其载体蛋白的体液免疫应答

戊型肝炎病毒衣壳蛋白内包含一个强H-2d限制性Th表位P34。以该表位肽免疫BALB/c鼠,其脾细胞能够在体外识别重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白,剔除实验表明应答细胞几乎完全是CD4 T细胞,证明P34表位肽能有效诱导产生特异性Th细胞。以P34肽初免小鼠,再以包含该表位的重组戊型肝炎病毒抗原(E2)免疫,结果表明,10μg、20μgE2免疫组在免疫后第1周即有部分小鼠产生抗体,到第3周所有小鼠均能够产生抗体;而对照肽P18初免的小鼠,以20μgE2加强免疫亦无法诱导小鼠产生抗体。这表明,Th表位肽P34初免诱导产生的Th细胞能够有效促进小鼠对携带该表位的载体蛋白的体液免疫应答。     

分子生物学技术在风疹病毒包膜糖蛋白研究中的应用

风疹病毒(RV)是最重要的人类致畸病毒。对RV包膜糖蛋白的研究,有助于构建与表达RVRNA病毒样颗粒,用于核酸检测质控品的研究与开发;并且有助于理解RV产生免疫的机理,以研制基因工程疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗等新型疫苗。本文对分子生物学技术在RV包膜糖蛋白研究中的应用进展进行了综述,包括风疹病毒RNA病毒样颗粒的构建与表达、建立风疹病毒免疫学诊断方法以及制备基因工程疫苗和亚单位疫苗的研究等。     

弓形虫新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保护研究

采用牛物信息学方法对弓形虫新基因wx2进行表位分析预测,PCR扩增基因中编码2个表位的片段w2b和w2a,成功构建新基因的单表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a和双表位疫苗pcDNA3-w2b2a,接种小鼠,观察表位疫苗的免疫保护作用.将表位疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3空质粒.ELJSA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群.各组小鼠末次免疫后第4周每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠的生存时间.结果显示,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P＜0.05),且pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠脾细胞CD4 T与CD8 T淋巴细胞比值明显低于两单表位疫苗组,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠存活时间明显长于两单表位疫苗组(P＜0.05).实验结果表明,弓形虫新基因wz2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,并且弓形虫poDNA3-W2b2a双表位疫苗的免疫保护性优于pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a两单表位疫苗.     

带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI-neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO-K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。     

表达埃博拉病毒表面糖蛋白的rVSV载体疫苗的效力与效果

正以表达扎伊尔埃博拉病毒表面糖蛋白的重组、可复制水泡性口炎病毒为基础的疫苗(rV SV-ZEBOV)是有希望的埃博拉病毒候选疫苗。本文主要描述了在西非的几内亚地区所做临床试验临时分析的结果。此次标签开放、群随机的环状疫苗接种实验,Basse-Guinée(几内亚,西非)的埃博拉病毒疑似病例由国家检测系统的埃博拉应急小组独立进行确诊。     

昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性

利用Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验,均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REVenv。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后,可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体,并可抵抗REV病毒感染。     

信号肽和辅助性T细胞表位增强HBV核心抗原DNA疫苗诱导的免疫应答

为增强HBVDNA疫苗的免疫效率 ,于HBV核心抗原 (HBcAg)基因 5′末端引入人IL 2信号肽和一个通用型辅助性T淋巴细胞表位基因 ,并构建成DNA疫苗 ,转染COS7细胞后经ELISA检测出分泌型HBcAg。通过肌肉注射途径分别将这种DNA疫苗和编码天然HBcAg的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,结果表明前者诱导细胞和体液免疫应答的强度均明显超过后者 ,且更趋向于T辅助细胞 1(Th1)型免疫应答 ,故其对慢性HBV感染的治疗可能有潜在的应用价值