PCR-DGGE研究微生物种群中多条带产生原因分析

鸡肠道微生物菌群经PCR-DGGE分析,回收PCR-DGGE分析胶上的一条DNA片段,回收的DNA片段再重复进行2次PCR-DGGE分析,以及分别用PCR反复循环扩增和PCR高保真酶扩增后再进行DGGE分析等方法研究PCR-DGGE分析中多条带产生原因。结果显示PCR-DGGE分析中多条带产生原因可能是作PCR扩增模板的DNA混杂有少量其他DNA片段,多条带现象不易被消除。DGGE分析胶上的DNA片段测序时,将该DNA片段回收、PCR扩增后克隆,提取多个阳性克隆菌的质粒DNA片段,分别与其原目的DNA片段进行DGGE分析,在DGGE分析胶上选取与原目的DNA片段处于同一电泳位置的质粒DNA测序,提高测序的准确性。     

基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

目的:构建基于Xcm I识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化。方法:首先将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理,分别将长度为312 bp和1 329 bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的 DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索。     

一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR

融合PCR技术（fusion PCR）采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR技术进行改进,以三个同源重组线性DNA片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR技术可以同时进行三个片段及四个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb以上,各同源重组片段在扩增过程中均无突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。     

影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素

在不同的电压与载样量下,分别使用溴化乙锭（EB）与新型核酸染料GoldViewna II及GoldView对凝胶中的DNA进行染色,观察电泳条带扭曲程度,了解电压、载样量与核酸染料对琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的影响.使用GoldViewna II染色,当电压≥10V/cm时,DNA条带的扭曲程度随载样量增大而加剧;当DNA载样量≥10ng时,DNA条带的扭曲程度随电压升高而加剧. 使用EB染色,仅当载样量≥50ng时,条带出现轻微扭曲,扭曲程度与电压无明显关系.结果表明使用GoldView染色,当电压不超过20V/cm或载样量不超过100ng时,DNA条带不扭曲.在琼脂糖凝胶电泳中,若要避免DNA条带扭曲干扰实验结果,使用GoldViewna II染色,若DNA载样量≥10ng,应控制电压≤5V/cm;使用EB染色,载样量应≤50ng;使用GoldView染色,可以使用20V/cm的电压缩短实验时间.     

基于多重PCR的DNA Marker制备方法

报道了一种简便的制备分子量大小为100-1000bp DNA marker的方法,其原理是以一段特异的DNA片段为模板,设计PCR引物,采用多重PCR的方法一次扩增100-1000bp系列条带,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,即可得到条带清晰的DNA marker。     

膳食诱导肥胖大鼠模型的肠道菌群结构及其特异分子标识物

目的通过对膳食诱导肥胖（Diet Induced Obesity,DIO）大鼠与健康对照组大鼠的肠道菌群结构的分析比较,寻找造成2组大鼠菌群结构差异的分子标识物,探讨肠道菌群的组成和结构与宿主肥胖之间的关系。方法ERIC—PCR结合Southern-blot得到肠道菌群基因组指纹图谱,利用Southem-blot与多元统计方法（PCA、PLS等）找出差异条带,回收差异条带进行测序,根据序列设计特异性引物,以定量PCR法对结果进行验证。结果ERIC-PCR图谱表明膳食诱导肥胖大鼠在肠道菌群结构上与正常大鼠存在着较大的区别;根据杂交结果找到一段基因组DNA片段为膳食诱导肥胖大鼠组所特有,定量分析表明该DNA片段在2组大鼠间区别明显。结论膳食诱导肥胖大鼠所特有的一段基因组DNA片段可作为肥胖大鼠肠道的特征分子标识物,该标识物有望用于膳食诱导肥胖的机制研究中。     

两种核酸染料染色效果的比较研究

用前染和后染两种不同的染色方法,研究比较SYBRGreenI和溴化乙锭(EB)两种核酸染料对凝胶中DNA的染色效果和灵敏度,及SYBRGreenI取代EB用于常规凝胶中核酸染色的可能性。结果表明,用前染法染色SYBRGreenI对琼脂糖凝胶中的核酸染色效果与EB相当;用后染法染色前者要优于后者,可显示5ng以下的DNA条带,在完全相同的操作条件下,其染色DNA条带背景清晰,灵敏度较高。因此,无致突变性新型染料SYBRGreenI可替代强致突变性染料EB用于检测凝胶中DNA片段大小、含量等,从而减少由于使用EB带来的环境污染和人体健康危害。     

戴冕鹤性别的分子鉴定

戴冕鹤Grus nigricllis为单态性鸟,很难通过外观和形态区分性别.本文采用非损伤性采样羽毛提取DNA,利用P2-P8引物对CHD基因进行特异性扩增,分别用HaeIII和Asp700I处理PCR产物,然后经过限制性片段长度多态性分析,HaeIII处理后的PCR产物,雄性出现2条带,雌性出现3条带;Asp700I处理后的PCR产物,雄性出现1条带,雌性出现3条带,表明可以准确鉴定戴冕鹤的性别.本文建立了从非损伤采样的羽毛提取DNA,利用PCR和限制性片段长度多态性准确鉴定戴冕鹤性别的方法,为人工繁殖戴冕鹤时合理配置雌雄比例、提高繁殖率奠定了基础.     

实验大鼠泰泽菌检测方法的比较研究

目的　比较实验大鼠泰泽菌检测方法─nested PCR、IFA、免疫抑制诱发试验 触片染色镜检和组织病理学诊断。方法　根据泰泽菌 16SrDNA合成引物 ,对 16个菌株作nested PCR扩增并进行特异性、敏感性试验、验证。将此PCR应用于 2 0只免疫抑制Wistar大鼠和 5只非免疫抑制SD大鼠泰泽菌检测 ,并作IFA、常规细菌学检测和组织病理学诊断。结果　nested PCR中仅有泰泽菌出现 196bp特异性扩增条带 ;而 15株非泰泽菌均未出现此扩增条带。该PCR能检出 10pg泰泽菌DNA。将此PCR应用于大鼠泰泽菌检测 ,结果未检出阳性样品。nested PCR与常规细菌学检测、组织病理学诊断结果相一致。采用IFA方法 ,以购得的大鼠泰泽菌抗原片对上述 2 5份大鼠血清进行检测 ,结果有 6份血清产生非特异性反应。结论　采用IFA对动物群进行筛查出现阳性结果 ,须采用免疫抑制诱发试验、PCR和组织病理学诊断技术组合进一步验证。本研究建立的nested PCR方法 ,特异、敏感、快速 ,结合组织病理学诊断技术对实验动物泰泽菌感染可做出精确诊断。     

聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法

聚丙烯酰胶凝胶电泳具有极高的分辨率,用于DNA分析时,长度仅差0.2％（即对500bp样品中的1bp长度差异）也可以凝胶上分开,因此被广泛用于对DNA需要进行高分辨率分析的程序之中,直到目前为止它仍是DNA测序工作中DNA片段长度检测的主要手段。由于聚丙烯酰胺凝胶对荧光染料溴化乙锭的荧光有熄灭作用,EB染色法很难检测到少于10纳克的DNA条带,因此在传统的DNA测序工作中经常采用放射性同位素自显影方法来检测DNA带的位置,不但增加了实验成本,而且使操作本来就较为繁琐的聚丙烯酸胶凝胶电泳变得更加麻烦;利用荧光标记的方法虽然…     

间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的作用初探

目的:初步研究利用C3Spacer间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的影响及作用。方法:选取1个常用短串联重复序列(STR)位点,利用间隔子修饰该位点荧光标记引物,以DNA标准物质为模板进行PCR扩增,记录相应扩增产物DNA片段长度,进行修饰与长度变化的相关性分析。结果:选取STR位点D13S317,分别利用TTTTC3SpacerC3Spacer、TTTTC3Spacer、TTTT修饰R0X标记引物,相应扩增产物长度为182.67±0.05、182.19±0.11和181.6±0.19bp,未进行修饰的对照组引物扩增产物长度为177.09±0.15 bp,产物DNA片段长度随不同修饰基团的修饰发生规律性变化。结论:发现了一种修饰基团,用该基团修饰引物后,可在体外通过PCR反应改变扩增产物等位基因片段的大小,从而在不改变特异性引物信息的前提下使产物发生规律性位移,修饰基团与DNA片段大小呈内在相关性。     

琼脂糖凝胶电泳技术

九、碱性琼脂糖凝胶 科学家们认为,琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的一种极好的方法。这种技术操作简单,快速,并且还能解决在密度梯度离心中所存在的DNA片段不能充分分离的难题。此外,还能直接确定凝胶中DNA的位置:其方法是先用低浓度的能发荧光的具有插入本领的染料(溴乙锭),对胶中DNA条带进行染色;然后,把电泳胶置于紫外光下进行直接检测,其灵敏度可达1毫微克(ng)。     

利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物

目的：制备一套DNA分子量标准物。方法：利用多聚酶链式反应技术（PCR）,以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。结果：DNA分子量条带大小依次为1653bp、1173bp、691bp、606bp、496bp、401bp、326bp、238bp、155bp,条带分布适度、亮度清晰。结论：制备了能满足研究和实验室的要求DNA分子量标准物,和市售的相比,成本大大降低。     

变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用

由于从环境样品中分离和培养细菌的困难,分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落。近年来基于DNA方法的群落分析得到了迅速的发展,如PCR扩增技术,克隆文库法,荧光原位杂交法,限制性酶切片段长度多态性法,变性和温度梯度凝胶电泳法。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌,古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点,适合于调查种群的时空变化,并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。DGGE分析微生物群落的一般步骤如下：一是核酸的提取,二是16S rRNA,18S rRNA或功能基因如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX)和氨加单氧酶a一亚单位基因(amoA)片段的扩增,三是通过DGGE分析PCR产物。DGGE使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶能够有区别的解链PCR扩增产物。由PCR产生的不同的DNA片段长度相同但核苷酸序列不同。因此不同的双链DNA片段由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移。DNA解链行为的不同导致一个凝胶带图案,该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓。DGGE使用所有生物中保守的基因片段如细菌中的16S rRNA基因片段和真菌中的18S rRNA基因片段。然而同其他分子生物学方法一样,DGGE也有缺陷,其中之一是只能分离较小的片段,使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制。在某些情况下,由于所用基因的多拷贝导致一个种类多于一条带,因此不易鉴定群落结构到种的水平。此外,该技术具有内在的如单一细菌种类16S rDNA拷贝之间的异质性问题,可导致自然群落中微生物数量的过多估计。DGGE是分析微生物群落的一种有力的工具。不过为了减少DGGE和其它技术的缺陷,建议研究者结合DGGE和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能。     

用荧光标记MVR-PCR方法研究中国汉族人群DYF155S1基因座多态性

建立简便、实用的DYF155S1基因座基因分型的银染和荧光标记半自动分析方法,对中国汉族155个无关男性个体血样本DNA进行分型,两种方法分型结果一致。155人共检出66种等位基因,有38个等位基因仅出现1次。根据图谱中第一条DNA片段及DNA条带数从小至大命名,频率最高的为18和22号等位基因,其第一条DNA片段大小为180bp,DNA条带数为连续的16和17个,频率均为0.065。这一位点的基因多样性（h）为0.9789。155人中有25人表现为连续DNA谱带中有1个或2个DNA条带的丢失（mull repeat）,序列分析证明丢失的DNA条带位置对应于3型核心序列。结果表明,本文建立的分析方法能很好地揭示DYF155S1基因座5′端多态性,是目前仅作1次PCR能获得个体Y染色体多态信息较高的技术。用本方法建立的中国汉族人群DYF155S1基因座等位基因频率资料,为群体遗传学研究及法医学应用提供了基础资料。     

PCR技术在附红细胞体感染模型中的应用

目的以猪附红细胞体(E.suis)为例,建立套式PCR方法,定性测定E.suis感染大鼠血液中DNA,检验套式PCR方法在其动物模型应用中的实用性和可操作性。方法用阳性血液样品分别经腹腔、皮下及肌肉感染大鼠,定期采血,进行常规血涂片染色,并从血液中分离纯化E.suis,提取DNA,进行套式PCR法扩增,凝胶电泳定性。结果套式PCR经扩增后得到了一长度为498bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段;在整个实验过程中未见感染大鼠明显的临床症状。结论可以用大鼠建立猪附红细胞体动物感染动物模型;附红细胞体的感染方式有以下几种:腹腔、皮下及肌肉感染。在隐性感染的整个阶段,PCR方法依靠其高敏感性,作为猪附红细胞体感染大鼠模型检测指标之一,有其必要性和重要性。     

TT型病毒基因组的克隆与进化分析

利用PCR方法从输血传播性病毒 (transfusiontransmittedvirus,TTV)阳性标本中获得不同长度且重叠覆盖TTV基因组的DNA片段。将PCR扩增片段克隆到pT Adv载体中 ,筛选获得阳性克隆。DNA序列测定结果表明所克隆的片段为TTV基因组序列。利用DNA片段中特有的限制性内切酶位点将TTV的DNA片段首尾相连 ,得到近全长的基因组克隆 ,命名为TTV0 2 1。对TTV0 2 1的核酸序列进行分析 ,TTV0 2 1长 3472nt,存在 2个阅读框架ORF1和ORF2 ,分别编码 785和 1 46个氨基酸。将TTV0 2 1与其它已知的TTV基因组全序列进行了同源性比较 ,并进行进化分析。结果表明 ,TTV0 2 1序列与TTV分离株CHN2、BDH1的遗传距离较近 ,而与其它分离株相对较远。     

变性梯度凝胶电泳在实验小鼠细菌检测中的应用

目的 研究变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)在实验小鼠细菌检测中的应用。方法 根据16S rDNA V3区引物,PCR扩增3种实验小鼠(KM小鼠、NIH小鼠和BALB/c小鼠)呼吸道和盲肠段的细菌基因组DNA;扩增产物运用DGGE进行电泳检测,并分析条带数量间差异的统计学意义。结果 KM小鼠盲肠段条带12~18条,呼吸道条带5~10条;NIH小鼠盲肠段条带15~20条,呼吸道条带4~10条;BALB/c小鼠盲肠段条带10~15条,呼吸道条带0~7条。统计分析结果显示,KM小鼠和NIH小鼠在盲肠和呼吸道电泳条带数量上的差异无统计学意义( P >0.05);BALB/c小鼠与KM小鼠、NIH小鼠间的差异均有统计学意义( P <0.05)。结论 DGGE 在实验小鼠盲肠和呼吸道细菌检测中能较好地反映菌群的物种多样性。     

从体外扩增约2kb长的DNA片段看四种dNTPs和TaqDNA聚合酶对PCR的影响

影响PCR产物特异性和得率的因素很多,本文从实验得到的结果出发,对用PCR钓出较长DNA片段时dNTPs和Taq DNA聚合酶对其特异性和得率的影响进行了讨论。     

弓形虫特异DNA片段顺序分析及体外基因扩增

从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出了一个弓形虫特异DNA片段的克隆,对克隆的片段进行了部分顺序分析。根据所得DNA顺序,自行设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立了体外扩增弓形虫特异DNA顺序的聚合酶链反应(PCR)方法。4种不同来源的弓形虫株DNA、人工感染弓形虫的三头幼猪白细胞和胸腺DNA经过PCR扩增,均出现特异的扩增条带;而正常人、正常幼猪外围血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、溶组织内阿米巴和人巨细胞病毒DNA均不出现特异的扩增条带。对扩增产物进行了Southern印迹和限制性内切酶图谱分析,证明该PCR产物是弓形虫DNA特异的顺序。该方法可测出少至1pg的弓形虫DNA或1个弓形虫体的裂解液。本文分析的DNA顺序和设计合成的引物顺序数据,经电脑DNA数据库检索,证明无相同的顺序。本方法并具有简便、快速等优点,便于推广应用。